Тест шварцландера: Тест «Самооценка уровня притязаний по методике Шварцландера»

Эта книга предлагает подробное объяснение основных моделей и математических принципов, используемых при применении теории вероятностей к практическим задачам.Это дает читателю прочную основу для формулирования и решения многих видов вероятностных задач для получения дополнительных результатов, которые могут потребоваться для решения более сложных вопросов, а также для продолжения изучения широкого круга более сложных тем.

Большое внимание уделяется ясной и детальной разработке «концептуальной модели», которая служит мостом между любой реальной ситуацией и ее анализом с помощью математики вероятностей.На протяжении всей книги эта концептуальная модель не упускается из виду. Подробно рассматриваются случайные переменные в одном и нескольких измерениях, включая сингулярные случайные величины, преобразования, характеристические функции и последовательности. Также включены специальные темы, не освещенные во многих текстах о вероятности, такие как нечеткость, энтропия, сферически-симметричные случайные величины и связки.

Некоторые особенности книги:

• уникальная пошаговая презентация, организованная в 86 тематических разделов, которые сгруппированы в шесть частей
• более 200 диаграмм дополняют и иллюстрируют текст, что помогает ускорить понимание читателем из материала
• краткие ответы на обзорные вопросы, следующие за каждым разделом, с предоставленной таблицей ответов, укрепляют детальное понимание читателем материала, содержащегося в разделе
• проблемы, связанные с каждым разделом, обеспечивают практику применения обсуждаемых принципов, а в некоторых случаях расширить объем этого материала
• для преподавателей курса доступно отдельное онлайн-руководство по решениям.

Различные особенности этого учебника позволяют студентам инженерных специальностей хорошо разбираться в «механизмах» теории вероятностей. Они также делают книгу полезным ресурсом для самостоятельного изучения практикующими инженерами и исследователями, которым требуется более глубокое понимание конкретных тем.

Мутанты с низким содержанием глутатиона нарушают рост, но не проявляют повышенной чувствительности к умеренному дефициту воды

Abstract

Глутатион считается ключевым метаболитом для защиты от стресса, и часто предполагается, что его повышенные уровни положительно влияют на толерантность к стрессу.Чтобы исследовать, влияет ли глутатион на продуктивность растений и устойчивость растений к засухе, растения Arabidopsis дикого типа и аллельные серии из пяти мутантов ( rax1 , pad2 , cad2 , nrc1 и zir1 ) с пониженным Содержание глутатиона от 21 до 63% по сравнению с содержанием глутатиона дикого типа было фенотипически охарактеризовано по росту их побегов в контролируемых и ограничивающих воду условиях с использованием платформы фенотипирования побегов.В нестрессовых условиях мутант zir1 , содержащий только 21% глутатиона, демонстрировал ярко выраженный карликовый фенотип. Напротив, все другие мутанты с промежуточным содержанием глутатиона до 62% показали постоянно немного меньшие побеги, чем у дикого типа. Умеренный стресс засухи, вызванный изъятием воды до прекращения роста побегов, показал, что растения дикого типа и все мутанты реагировали одинаково с точки зрения флуоресценции хлорофилла и задержки роста. Эти результаты приводят к выводу, что глутатион важен для общей продуктивности растений, но что содержание глутатиона не влияет на устойчивость к умеренным засушливым условиям, типичным для сельскохозяйственных культур в поле.

Образец цитирования: Bangash SAK, Müller-Schüssele SJ, Solbach D, Jansen M, Fiorani F, Schwarzländer M, et al. (2019) Мутанты с низким содержанием глутатиона нарушают рост, но не проявляют повышенной чувствительности к умеренному дефициту воды. PLoS ONE 14 (10): e0220589. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220589

Редактор: Кэцян Ву, Национальный университет Тайваня, Тайвань

Поступила: 16 июля 2019 г .; Одобрена: 4 октября 2019 г .; Опубликовано: 18 октября 2019 г.

Авторские права: © 2019 Bangash et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках исследовательской учебной группы GRK 2064 (AM; MS; SJM-S), грант ME1567 / 9-1 / 2 в рамках приоритетной программы SPP1710 (AM), программа Emmy-Noether (SCHW1719 / 1-1; MS) и Excellence Initiative (EXC 1028; SK).Благодарим CoSens за грант Фонда посевов от Научного центра биоэкономики, NRW (AM; MS). Научная деятельность Научного центра биоэкономики финансируется Министерством инноваций, науки и исследований в рамках NRW Strategieprojekt BioSC (№ 313 / 323-400-002 13). SB получил финансовую поддержку в виде стипендии Комиссии высшего образования Пакистана.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Урожайность сильно ограничена факторами стресса окружающей среды, что приводит к разрыву между потенциальной урожайностью и фактической урожайностью. Прогнозируется, что разрыв в урожайности увеличится в будущем из-за изменения климата и, в частности, из-за повышения температуры и продолжительных фаз умеренной и сильной засухи [1–4]. Понимание механизмов толерантности и защиты растений является обязательным для селекции культур, способных обеспечить высокий урожай даже в периоды кратковременного стресса.Рост растений и защита от стресса контролируются множеством различных факторов, создающих жесткие регулирующие сети, которые обеспечивают пластичность, необходимую для обеспечения выживания и урожайности растений даже в неблагоприятных условиях. Трипептид глутатион (GSH) считается ключевым метаболитом в защитных реакциях растений против биотических и абиотических факторов стресса [5]. Одной из важных функций GSH является детоксикация активных форм кислорода и органических пероксидов, которые часто образуются в стрессовых ситуациях [6,7].H ₂ O ₂ частично детоксифицируется посредством цикла глутатион-аскорбат, в котором аскорбатпероксидазы восстанавливают H ₂ O ₂ за счет аскорбата [8]. Дегидроаскорбат, в конечном итоге образующийся в результате окисления аскорбата, впоследствии восстанавливается GSH, что приводит к образованию дисульфида глутатиона (GSSG), который затем снова восстанавливается глутатион-дисульфидредуктазами (GR). Недавно было показано, что цикл глутатион-аскорбат и дегидроаскорбатредуктаза, в частности, играют центральную роль в минимизации потерь урожая зерна риса, вызванных засухой [9].Было показано, что мутанты Arabidopsis, лишенные GR в цитозоле, имеют немного менее отрицательный окислительно-восстановительный потенциал глутатиона ( E _GSH ) [10]. Также было показано, что цитозольный GR играет решающую роль в ответах листа на внутриклеточный H ₂ O ₂ и в регуляции экспрессии генов посредством сигнальных путей салициловой кислоты и жасмоновой кислоты [11].

Окисление двух молекул GSH приводит к образованию одной молекулы GSSG, что делает E _GSH зависимым как от степени окисления, так и от общего количества глутатиона [12].Пул глутатиона в цитозоле, пластидах, митохондриях и пероксисомах, однако, находится в восстановленном состоянии с почти 100% GSH (в низком диапазоне мМ) и только наномолярными концентрациями GSSG [13,14]. GSH синтезируется в две ферментно-зависимые стадии, катализируемые глутамат-цистеинлигазой (GSh2) и глутатионсинтазой (GSh3). Путь биосинтеза контролируется отрицательной обратной связью GSH на первом ферменте GSh2 [15]. Учитывая, что GSH является ключевым метаболитом в реакциях защиты от стресса, неудивительно, что несколько независимых генетических скринингов для мутантов, чувствительных к абиотическим или биотическим стрессам, привели к выделению мутантов со сниженным содержанием GSH, вызванным мутациями в GSh2 [16-21].Мутанты с промежуточным уровнем GSH от 20 до 40% часто описываются с фенотипом дикого типа в контрольных условиях [18], хотя в некоторых сообщениях также указывается немного замедленный рост [22]. Причинная связь между GSH и ростом растений особенно подчеркивается толерантностью к цинку у мутантов Arabidopsis , индуцированной железом 1 ( zir1 ), которое развивается как карлик и содержит только 15% GSH дикого типа и корневых меристем 1 ( rml1 ), у которых постэмбриональное развитие в значительной степени отменено из-за почти полного отсутствия GSH [20,21].

Как ключевой метаболит в цикле глутатион-аскорбат и предполагаемый кофактор для других систем улавливания АФК, таких как S-трансферазы глутатиона (GST), глутатион часто связывают с общими стрессовыми реакциями у растений [5]. Известно, что во время реакции на стресс засухи замыкающие клетки продуцируют H ₂ O ₂ , который может использоваться для передачи сигналов, но также нуждается в детоксикации, чтобы избежать серьезных повреждений [23,24]. Считается, что крупномасштабные изменения клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза и, в частности, E _GSH связывают первичные стрессовые реакции с нижележащими мишенями [12,25].Стресс-зависимые изменения в E _GSH могут быть визуализированы в живых клетках с окислительно-восстановительным GFP (roGFP) [13,26,27], и был поднят вопрос, может ли тяжелый водный стресс вызвать окислительную реакцию, которая может быть участвует в передаче сигналов о засухе. В то время как жесткие гипоосмотические методы лечения (1 M маннитол) не вызывали каких-либо острых эффектов, по данным биосенсора roGFP2 [28]. Jubany-Mari и его коллеги сообщили о постепенном окислительном сдвиге около 10 мВ в цитозоле, вызванном засухой, в течение нескольких дней [29].

Последнее открытие поставило вопрос о том, участвуют ли изменения в E _GSH в реакции дефицита воды и нарушены ли в ответе мутанты с измененным E _GSH . Первые эксперименты по ответу на этот вопрос дали противоречивые результаты. Сверхэкспрессия первого и регуляторного фермента биосинтеза GSH, GSh2, в табаке, как сообщается, придает устойчивость к стрессу засухи [30]. В соответствии с этим, повышенный уровень GSH, как сообщается, придает устойчивость к засухе и солевому стрессу, в то время как частично GSH-дефицитный мутант pad2 показывает значительно более низкую выживаемость, чем растения дикого типа после двухнедельной обработки засухой [31].Напротив, недавно сообщалось, что дефицит GSH у растений pad2 не влияет на реакцию дефицита воды в течение 9-дневного периода засухи [32]. Аналогичным образом, также сообщалось, что частичное истощение GSH в мутантных аллелях gsh2 cad2 , pad2 и rax1 не оказало отрицательного воздействия на площадь листьев проростков, подвергшихся краткосрочному абиотическому стрессу [22 ]. Удивительно, но отрицательные эффекты длительного воздействия окислительного стресса и высоких концентраций соли на площади листьев были менее выражены у мутантов по синтезу GSH, чем у растений дикого типа.Очевидное противоречие между этими исследованиями может быть результатом различных методов лечения стресса и разных систем оценки, регистрирующих либо выживаемость [31], либо увеличение биомассы и площадь листьев [22,32]. Кроме того, информативная ценность многочисленных исследований роли GSH в устойчивости к стрессу ограничена тем фактом, что часто только отдельные мутанты сравнивают с растениями дикого типа. Шнаубельт и др. . учли этот момент, тестируя три разных мутанта, которые, однако, все содержали промежуточные уровни GSH с небольшими фенотипическими вариациями в нестрессовых условиях [22,33].Кроме того, режимы сильного стресса, использованные в этом исследовании с высоким содержанием соли (75 мМ NaCl) и осмотическим стрессом (100 мМ сорбитол), а также оценка четко видимых макроскопических маркеров вряд ли обеспечат уточненную картину чувствительности к стрессу у Arabidopsis. Такая стратегия может быть особенно проблематичной при использовании для оценки того, влияют ли на рост мутантных или трансгенных линий изменения сигнальных путей стресса из-за трудностей с экспериментированием, включая возможное физическое повреждение корней и поглощение осмотика во время переноса и возможное поглощение и разрушение осмотического вещества. [2,34].Точно так же жесткая обработка засухи, в конечном итоге приводящая к увяданию и гибели выращиваемых в почве растений, не подходит для сравнения характеристик различных генотипов с разными характеристиками роста, например, для более мелких растений [35].

Чтобы более подробно изучить потенциальную роль GSH в реакции растений Arabidopsis на умеренный дефицит воды, мы расширили аллельный ряд GSH-дефицитных мутантов, использованных Schnaubelt et al . [22,33] последними добавлениями, а именно мутантами nrc1 [19] и zir1 [20], из которых последний особенно интересен с учетом его описанного карликового фенотипа.Растения дикого типа и все мутанты сравнивали бок о бок на предмет их роста и устойчивости к засухе с использованием передового неинвазивного высокопроизводительного фенотипирования побегов, позволяющего непрерывно регистрировать ростовые реакции. Мы демонстрируем, что GSH-дефицитные мутанты демонстрируют замедленный рост, который более выражен у мутантов с низким GSH, в то время как даже у мутантов с выраженным дефицитом роста снижение GSH не оказывает отрицательного воздействия на устойчивость к умеренной засухе.

Материалы и методы

Растительный материал и условия роста

Arabidopsis thaliana L.(Heyn.) Экотип Columbia-0 (Col-0) использовали во всех экспериментах в качестве контроля дикого типа. Мутанты с дефектами GSh2 (At4g23100) были предоставлены коллегами, которые сообщили об их выделении и первоначальной характеристике. Растения арабидопсиса выращивали на смеси почвы (www.floragard.de), песка и перлита в соотношении 10: 1: 1 и содержали в камерах с контролируемым выращиванием в условиях долгого дня с 16-часовым светом при 19 ° C и 8-часовым темным светом при 19 ° C. 17 ° С. Интенсивность света поддерживалась между 50 и 75 мкЕм ^-2 с ^-1 и относительной влажностью 50%.Семена дикого типа и все мутанты собирали одновременно и использовали в одном и том же возрасте для всех дальнейших экспериментов. Для первоначальной фенотипической и физиологической характеристики проростки выращивали на вертикально ориентированных чашках с агаром в стерильных условиях. Поверхность семян стерилизовали 70% (об. / Об.) Этанолом в течение 5 минут и высевали на стандартную среду MS половинной концентрации (M0222.0050; Duchefa, www.duchefa-biochemie.nl) с добавлением 0,5% (мас. / Об.) ) сахарозы и затвердевали с 0,8% (мас. / об.) агаром. Затем семена стратифицировали в течение 2 дней в темноте при 4 ° C и проращивали в условиях длинного дня при 16-часовом освещении при 22 ° C и 8-часовом темноте при 18 ° C.Интенсивность света составляла 75 мкЕ · м ^-2 с ^-1 и относительная влажность 50%.

Подробная информация об условиях роста, применяемых в крупномасштабных экспериментах по неинвазивному фенотипированию, представлена ​​в описаниях соответствующих методов.

Анализ низкомолекулярных тиолов

Примерно 20 мг растительного материала из 5-дневных проростков, выращенных на чашках в стерильных условиях, гомогенизировали и экстрагировали в 10-кратном объеме 0,1 н. HCl. Образцы центрифугировали 10 мин при 4 ° C.25 мкл супернатанта смешивали с 20 мкл 0,1 М NaOH и 1 мкл 100 мМ свежеприготовленного дитиотреитола (DTT) для количественного восстановления дисульфидов. Образцы встряхивали, центрифугировали и выдерживали 15 мин при 37 ° C в темноте. После этого к образцам смешали 10 мкл 1 М трис / HCl pH 8,0, 35 мкл воды и 5 мкл 100 мМ монобромбимана в ацетонитриле (Thiolyte ^® MB, Calbiochem, www.merckmillipore.com). Образцы встряхивали, центрифугировали и выдерживали 15 мин при 37 ° C в темноте.Добавляли 100 мкл 9% (об. / Об.) Уксусной кислоты, образцы встряхивали и центрифугировали при 13000 g в течение 15 мин при 4 ° C. 180 мкл супернатанта помещали во флаконы для ВЭЖХ. Конъюгаты тиолов разделяли с помощью ВЭЖХ (SpherisorbTM ODS2, 250 × 4,6 мм, 5 мкм, Waters, http://www.waters.com) с использованием буфера C (10% (об. / Об.) Метанол, 0,25% (об. / Об.) уксусная кислота, pH 3,7) и D (90% (об. / об.) метанол, 0,25% (об. / об.) уксусная кислота, pH 3,9). Протокол элюции использовался с линейным градиентом от 4 до 20% D в C в течение 20 минут, при скорости потока, установленной на 1 мл / мин.Бимановые аддукты детектировали флуориметрически (UltiMate ^™ 3000, Thermo Fisher, http://www.thermofisher.com) при возбуждении при 390 нм и испускании при 480 нм.

Фенотипическая характеристика роста побегов и реакции на стресс, вызванный засухой

Рост побегов анализировался автоматически с использованием установки GROWSCREEN FLUORO, описанной ранее [36,37]. Семена WT и всех мутантных линий gsh2 стратифицировали в течение 3 дней при 4 ° C в темноте, а затем помещали в горшки по отдельности.Впоследствии семена проращивали, и на седьмой день после прорастания проростки аналогичного размера переносили в горшки большего размера (7 × 7 × 8 см) и случайным образом распределяли по лоткам с 30 растениями на каждом лотке. В исключительных случаях после переноса растения погибали и исключались из дальнейшего анализа. Затем растения выращивали в камерах для выращивания в полностью контролируемых условиях при 22/18 ° C, 170 мкмоль · м ^–2 с ^–1 фотосинтетически активном излучении и 8/16 часовом режиме день / ночь. Влажность почвы (SWC) регистрировали гравиметрически.После первоначального замачивания SWC позволили уменьшиться до значения прибл. Достигнуто 40%. Впоследствии этот SWC был проведен путем периодического добавления воды. Начиная с 15 дня после посева, у всех растений сначала регистрировали прогнозируемую площадь листьев (PLA) и флуоресценцию хлорофилла каждый второй день. Во время фазы экспоненциального роста побегов на 5 и 6 неделе после посева все параметры роста собирали ежедневно. Все показания были сняты около полудня, чтобы убедиться, что розетки ориентированы почти горизонтально над почвой.PLA A ₁ и A ₂ для двух последовательных дней были использованы для расчета относительной скорости роста побегов (RGR _Shoot ) (% d ^-1 ) в соответствии с уравнением RGR _Shoot = 100 × 1 / t × ln (A ₂ / A ₁ ). Флуоресценцию хлорофилла регистрировали после адаптации к темноте в течение не менее 30 минут с помощью системы на основе камеры для расчета цветных изображений F _v / F _m в качестве меры потенциального квантового выхода фотосистемы II.Для дальнейшего анализа были рассчитаны средние значения для F _v / F _m для целых розеток.

Для экспериментов со стрессом засухи растения были разделены на две субпопуляции, из которых первая популяция хорошо поливалась на протяжении всего эксперимента, в то время как вторая популяция подвергалась засухе с 24-го дня до прекращения роста на 37-й день. Затем растения снова поливали до влажность почвы около 40% и позволила восстановиться. Все растения собирали через 44 дня для определения сырой и сухой массы.

Определение морфологии розетки

Окружность листа, плотность розетки, приземистость розетки и эксцентриситет были рассчитаны на основе PLA, как описано ранее [36].

Ратиометрическая визуализация roGFP2

5-дневных проростков Arabidopsis, стабильно экспрессирующих Grx1-roGFP2 в цитозоле. Проростки помещали на предметное стекло в каплю дистиллированной воды и сразу переносили в конфокальный микроскоп Zeiss LSM780. Изображения кончиков корней и семядолей получали с помощью линзы с 40-кратным увеличением (Zeiss C-Apochromat 40x / 1.2 NA) или линза с 25-кратным увеличением (Zeiss Plan-Apochromat 25x / 0,8 Imm Korr) соответственно. RoGFP2 возбуждали в многодорожечном режиме с переключением линий между лазерными линиями 405 и 488 нм. Для корней изображения были собраны с размером пикселя 0,415 мкм по x и y и временем задержки пикселя 1,58 мкс, а для семядолей с размером пикселя 0,664 мкм по x и y и временем задержки пикселя 2,55 мкс. Отверстие было установлено на 73 мкм (2,0–2,3 единицы Эйри в зависимости от длины волны). Эмиссия собиралась от 508 до 535 нм.Автофлуоресценция, возбужденная на 405 нм, собиралась от 430 до 470 нм. Изображения обрабатывались с использованием специально созданного инструмента MATLAB с фильтрацией шума x, y, вычитанием фона флуоресценции и коррекцией автофлуоресценции, как описано ранее [38].

Статистический анализ

Статистический анализ выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7. Различные наборы данных анализировали на предмет статистической значимости с помощью одно- и двустороннего дисперсионного анализа (одно- и двусторонний дисперсионный анализ) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

Результаты

Тяжелый осмотический стресс, вызванный маннитом, вызывает частичное окисление цитозольного глутатиона

Чтобы исследовать влияние осмотической нагрузки на растения Arabidopsis, мы первоначально выращивали проростки, экспрессирующие E _GSH -сенсор Grx1-roGFP2 в цитозоле на 300 мМ манните для имитации сильного стресса засухи. Помимо проростков дикого типа, влияние маннита на E _GSH также было изучено на мутантах gr1 , дефицитных по цитозольному GR, поскольку нарушение восстановительной способности GSSG делает пул глутатиона более чувствительным к стресс-индуцированному окислению [10 ].В соответствии с нашими более ранними сообщениями [10] соотношение флуоресценции 405/488 нм в семядолях дикого типа, выращенных в контрольных условиях, указывало на почти полное восстановление roGFP2, в то время как зонд был частично окислен в цитозоле семядолей gr1 и (S1A фиг.). В то время как рост на 300 мМ манните в течение 5 дней не вызывал видимого окисления в семядолях дикого типа, очень выраженное окисление наблюдалось в семядолях gr1 (S1A фиг.). Точно так же соотношение флуоресценции 405/488 нм для Grx1-roGFP2 в кончиках корней дикого типа было близко к значениям для полного восстановления, измеренным после инкубации с DTT, считывание цитозоля корней gr1 было значительно выше при промежуточных соотношениях между полное восстановление и полное окисление датчика (S1B Рис).Из этих измерений можно вывести цитозольный окислительно-восстановительный потенциал около -310 мВ у дикого типа и близкий к средней точке датчика при -280 мВ для gr1 . В обоих случаях для проростков дикого типа и проростков gr1 обработка 300 мМ маннита не вызвала значительных изменений соотношения флуоресценции в течение первых 16 часов. Это указывает на то, что в течение этого временного окна проростки все еще были полностью способны поддерживать свой окислительно-восстановительный гомеостаз тиола в цитозоле. В отличие от этого наблюдения, непрерывный рост на 300 мМ маннита в течение 5 дней вызывал выраженный сдвиг соотношения между кончиками корней дикого типа и gr1 .В то время как значения отношения в кончиках корней дикого типа достигли промежуточных значений, отношения в кончиках корней gr1 приблизились к полному окислению в корневом покрове, в то время как меристематическая область все еще оставалась частично восстановленной (S1C фиг.).

Основываясь на наших наблюдениях, что длительный стресс засухи влияет на E _GSH и вызывает окисление в цитозоле, а также на опубликованных отчетах о снижении засухоустойчивости мутантов с дефицитом GSH [31], мы решили проверить гипотеза о том, что содержание GSH в растениях Arabidopsis коррелирует с чувствительностью к засухе.

Составление аллельной серии мутантов

Несколько генетических скринингов привели к идентификации различных мутантных аллелей gsh2 , которые, как сообщалось, были GSH-дефицитными, хотя и в разной степени. Однако для степени истощения GSH часто указываются значения между 20 и 40% GSH по сравнению с растениями дикого типа, что не позволяет однозначно ранжировать мутанты по содержанию GSH.Хотя уровни GSH действительно могут варьироваться в зависимости от условий роста, аннотация мутантов с диапазоном концентраций GSH затрудняет выбор наиболее подходящих аллелей для сравнительной экспериментальной работы. Чтобы ранжировать все пять доступных мутантов аллельной серии, которые могут поддерживаться в их гомозиготном состоянии в соответствии с уменьшением содержания GSH, проростки выращивали в контролируемых условиях на чашках с агаром и анализировали на содержание в них GSH. Анализ ВЭЖХ выявил разделение мутантов дикого типа и различных мутантов gsh2 на 3 различных класса (рис. 1А).Проростки дикого типа содержали 273 ± 39 нмоль г глутатиона ^-1 FW и проростки rax1 142 ± 46 нмоль г ^-1 FW. Третий класс включал pad2 , cad2 , nrc1 и zir1 , которые все содержали менее 73 нмоль глутатиона ^-1 FW. Хотя статистически значимых различий нет, измеренное среднее содержание глутатиона в zir1 составляло всего 45 ± 20 нмоль г ^-1 FW и, следовательно, ниже, чем в трех других мутантах этого класса.Истощение GSH из-за мутаций в GSh2 сопровождалось сопутствующим увеличением цистеина как одного из субстратов GSh2 (Рис. 1B).

Рис. 1. Содержание глутатиона в серии аллельных мутантов, дефицитных по глутамат-цистеинлигазе.

( A, B ) Анализ ВЭЖХ общего глутатиона, представленного в виде эквивалентов GSH ( A ) и цистеина ( B ​​) в 5-дневных проростках. Представленные значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n = 5). Строчные буквы указывают на статистически разные значения (односторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Тьюки; p <0.05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220589.g001

Выращенные в почве мутанты с дефицитом GSH проявляют фенотипы роста, но нечувствительны к умеренному дефициту воды

Чтобы изучить взаимосвязь между содержанием глутатиона и приростом биомассы в условиях засухи, мы проанализировали рост мутантов gsh2 и дикого типа в тесте сублетального стресса засухи. Большая популяция выращиваемых в почве растений была разделена на две субпопуляции, одна из которых использовалась в качестве хорошо поливаемой контрольной группы, а вторая подвергалась стрессу засухи до тех пор, пока рост не прекратился (рис. 2А и 3).В конце засушливого периода растения еще не проявляли явных признаков увядания (рис. 3). После периода засухи все растения снова поливали до достижения SWC около 40–50% в течение еще одной недели перед сбором урожая (рис. 2A). В популяции растений, выращиваемых с достаточным запасом воды на протяжении всего периода роста, не наблюдалось отчетливого фенотипа роста для cad2 (рис. 2B и 4C). Мутанты с дефицитом глутатиона rax1 , pad2 и nrc1 были стабильно меньше, чем растения дикого типа, до 30% в конце 6-недельного периода роста (фиг. 2B и 4C).Задержка роста была очевидна уже на 22-й день после посева (рис. 4А). В отличие от мутантов с промежуточными уровнями GSH, zir1 обнаружил отчетливый карликовый фенотип с только 19% биомассы дикого типа.

Рис. 2. На снижение роста, вызванное засухой, не влияет содержание GSH в растениях Arabidopsis.

(A ) Режим полива и содержание влаги в почве во время эксперимента для растений, подвергшихся засухе (пунктирная линия) и контрольных растений (сплошная линия).( B ​​, C ) Снимайте свежую массу в условиях контроля и засухи соответственно в конце периода роста через 6 недель. Растения выращивали в заполненных почвой горшках в условиях короткого дня и подвергались водному стрессу, как показано на панели A . Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n ≥ 10). Буквы на каждом графике указывают на значимые различия (односторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Тьюки; p <0,05).

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0220589.g002

Рис. 4. Прогнозируемая площадь листьев (PLA) у мутантов дикого типа и мутантов gsh2 , выращенных в контрольных и стрессовых условиях засухи в горшках, заполненных почвой.

( A , B ​​) Непрерывная регистрация PLA в течение всего периода роста для хорошо поливаемых контрольных растений ( A ) и растений, подвергшихся стрессу засухи ( B ​​). На вставке ( A ) показан PLA хорошо поливаемых растений 22 DAS, чтобы подчеркнуть, что здесь уже можно увидеть различный рост.Идентификаторы различных кривых роста приведены в ( B ​​). ( C , D ) PLA во время сбора урожая 44 DAS для контрольных ( C ) и подверженных засухе ( D ) растений. ( E , F ) PLA для дикого типа и всех мутантов gsh2 под контролем ( E ) и в условиях дефицита воды ( F ), измеренных в конце периода роста. Для расчета регрессии начало координат (точка 0/0) было включено в качестве дополнительной виртуальной точки данных.( G ) Относительный PLA. Рассчитанная линейная регрессия указывает на прямую корреляцию между PLA в условиях засухи и контрольными условиями для всех исследуемых линий растений. Все значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n ≥ 16, распределенные случайным образом на 8 лотках).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220589.g004

Отсутствие водоснабжения в течение 13 дней в течение всей фазы роста в 44 дня вызывало выраженную задержку роста у растений дикого типа примерно на На 50% по сравнению с хорошо политыми контролями зарегистрировано уменьшение свежей и сухой массы побегов, а также PLA (рис. 2B, 2C и 4A – 4D, а также S2A и S2C, рис).Содержание воды в побегах в конце эксперимента было одинаковым у контрольных растений и растений, подвергшихся стрессу засухи, что указывает на то, что примененный стресс засухи не вызвал серьезных повреждений, таких как необратимые поражения (S2B и S2D, рис.). Прямое сравнение мутантов gsh2 , подвергшихся стрессу засухи, и соответствующих мутантов дикого типа показало, что для промежуточных GSH-дефицитных мутантов относительное замедление было менее выражено, чем в контрольных условиях, или даже не могло быть обнаружено статистически (рис. 2C, 4D и S2C, рис. ).Основным исключением с наиболее выраженным отличием от дикого типа является zir1 , для которого задержка так же четко видна по всем зарегистрированным параметрам. Тяжелый карликовый фенотип zir1 позволил провести дальнейший анализ PLA в конце эксперимента для всех мутантов, несмотря на отсутствие последовательных фенотипических различий для промежуточных мутантов. Сравнение PLA с сухой массой (DW) для хорошо поливаемых контрольных растений и растений, подвергшихся стрессу засухи, привело к линейным зависимостям, указывающим на то, что конкретная площадь листьев (PLA g ^-1 DW) в каждой группе растений не зависит от дефицит глутатиона (рис. 4E и 4F).Чтобы дополнительно проверить, являются ли мутанты с очень низким GSH более серьезно затронутыми засухой, чем мутанты с промежуточными уровнями GSH и растения дикого типа, мы построили график PLA стрессированных засухой растений против PLA контрольных растений. Линейная зависимость четко указывает на то, что даже мутанты с низким GSH, которые растут как карлики, не сильно страдают от их способности противостоять умеренному дефициту воды (рис. 4G).

Задержка роста, вызванная засухой, также была очевидна при непрерывной регистрации PLA (рис. 4A – 4D) и RGR _Shoot , рассчитанных на основе этих измерений (рис. 5A и 5B).Регулярное измерение PLA в течение всего периода роста также позволило рассчитывать относительную скорость роста побегов (RGR _Shoot ) на ежедневной основе. RGR _Побег в контрольной популяции постепенно уменьшался с 28% d ^-1 в начале регистрации на 16 день после посева до 12% d ^-1 в конце периода роста (рис. 5A). В течение всего периода роста не было очевидных отклонений в RGR _Shoot между диким типом и различными мутантами gsh2 с промежуточным содержанием GSH.Для zir1 RGR _Shoot показал аналогичное снижение с течением времени, но было несколько прерывистых дней со значительно более низким RGR _Shoot , чем у всех других растений (рис. 5A). В популяции, подвергшейся стрессу от засухи, RGR _Побег уменьшался значительно быстрее в течение периода роста, приближаясь к нулю после 13 дней забора воды (рис. 5B и 5C). Период стресса засухи начался случайно во время фазы, когда zir1 уже показал особенно низкие значения для RGR _Shoot в контрольной популяции (рис. 5A и 5B).С этого момента и далее RGR _Shoot был стабильно ниже по содержанию zir1 по сравнению со всеми другими линиями в течение почти всего периода засухи (рис. 6B). Сразу после повторного полива на 37 день RGR _Shoot увеличился до пиковых значений примерно 20% d ^-1 на 41 день и последующего снижения до значений примерно 15% d ^-1 на 43 день для всех линий, включая цир1 . После повторного полива мутанты с дефицитом глутатиона даже показали тенденцию к более быстрому росту по сравнению с растениями дикого типа (рис. 5B и 5C).

Рис. 5. Относительная скорость роста побегов (RGR _Shoot ) у мутантов дикого типа и мутантов gsh2 , выращенных в контрольных и стрессовых условиях засухи.

Непрерывная регистрация RGR _Побег в течение всего периода роста для контрольных ( A ) и подверженных засухе растений ( B ​​). Период водозабора для населения, пострадавшего от засухи, обозначен серой тенью. Забор воды закончился, когда RGR _Shoot приблизился к нулю на 37 день.( C ) Сравнение относительных скоростей роста растений в хорошо поливных и подверженных засухе популяциях в трех критических временных точках во время эксперимента. Символы для разных линий используются, как описано на панели A .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220589.g005

Рис. 6. Потенциальный квантовый выход ФСII (F _v / F _m ) арабидопсиса дикого типа и мутантов gsh2 , выращенных под борьба с засухой и стрессовыми условиями.

( A ) F _v / F _m в последний день засушливого периода 37 DAS. ( B ​​) F _v / F _m в конце эксперимента 43 DAS. Все значения являются средними значениями ± стандартное отклонение ( n ≥ 16 растений). Звездочки на каждом графике указывают на значительные различия в пределах одного и того же генотипа, а буквы на каждом графике указывают на значительные различия между генотипами, как определено с помощью двустороннего дисперсионного анализа с тестом множественных сравнений Тьюки; р <0.05). Для Col-0 и zir1 контрольные растения и растения, обработанные засухой, сравнивали отдельно (обозначены индексными числами). Поскольку все другие мутанты существенно не отличались от мутантов дикого типа, соответствующие буквы были опущены для простоты. Значения для растений, выращенных в контрольных условиях, показаны сплошным цветом, а значения для растений, испытывающих дефицит воды, показаны столбиками с заштрихованными узорами.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220589.g006

При каждом измерении всех отдельных растений потенциальный квантовый выход фотосинтеза (F _v / F _m ) регистрировали после адаптации к темноте в течение не менее 30 минут. На основании измерений всей розетки были рассчитаны отдельные средние значения для соответствующих розеток. У растений, содержащихся в хорошо увлажненных контрольных условиях на протяжении всей фазы роста, F _v / F _m достигал значений от 0,71 до 0,72 для растений дикого типа и для мутантов с промежуточными уровнями GSH ( rax1 , pad2 , cad2 и nrc1 ).Немного, но значительно более низкие значения для F _v / F _m от 0,70 до 0,71 были обнаружены только в более сильно обедненном GSH zir1 . Хотя различия между контрольными растениями и растениями, подвергшимися засухе, были очень небольшими во всех исследуемых линиях, наблюдалась тенденция к незначительному увеличению значений для F _v / F _m у растений, подвергшихся засухе, как в последний день периода засухи. и непосредственно перед сбором урожая в конце эксперимента после полного восстановления растений, подвергшихся стрессу от засухи (рис. 6A и 6B).Эта разница достигла значимости только для pad2 , cad2 и nrc1 в последний день фазы засухи и для cad2 во время сбора урожая.

Запись PLA и последующий анализ изображений позволили выделить дополнительные морфологические характеристики формы розетки. Эти факторы включали площадь по окружности, компактность розеток как меру длины черешков, приземистость розетки как показатель степени отступа розетки и эксцентриситет как параметр, описывающий форму розетки по сравнению с круг.Как правило, все параметры отражают измерения PLA (S3 Рис). Единственным исключением был zir1 , который показал повышенную коренастость по сравнению со всеми другими линиями. Из-за более раннего снижения RGR _Shoot zir1 также развилась более компактная розетка, плато коренастой розетки и более выраженный эксцентриситет после наступления засухи.

Обсуждение

Глутатион влияет на рост в нестрессовых условиях

Глутатион-дефицитные мутанты были идентифицированы в ходе генетического скрининга на чувствительность к тяжелым металлам ( cad2 ) [16], экспрессию гена защиты от стресса ( rax1 ) [17], чувствительность к патогенам ( pad2 ) [18], отсутствие кадмий-индуцированная экспрессия гена ( nrc1 ) [19] и опосредованная железом толерантность к цинку ( zir1 ) [20].Параллельное сравнение всех доступных жизнеспособных мутантов gsh2 по содержанию глутатиона выявило разные уровни у разных мутантов. Наблюдение, что rax1 содержит больше глутатиона, чем cad2 и pad2 , подтверждает более раннее сообщение Parisy et al. [18], а самое низкое содержание глутатиона в zir1 согласуется с первоначальным сообщением об этом мутанте [20]. Уровень глутатиона nrc1 очень близок к уровню глутатиона cad2 , что соответствует их аналогичной чувствительности к Cd ²⁺ [19].Фенотипическое сравнение показало, что рост всех мутантов, кроме cad2 , был нарушен, хотя и в разной степени. Мутанты zir1 были значительно меньше всех остальных. Сравнение наших результатов с данными из более ранних отчетов об отдельных мутантах или параллельное сравнение подмножества мутантов выявило некоторые явные различия. Хотя Schnaubelt et al. [22] сообщили, что 14-дневные побеги rax1 , pad2 и cad2 были значительно меньше, чем побеги дикого типа, исходные отчеты о первоначальной характеристике cad2 , rax1 и pad2 все не обнаружили фенотипических различий между мутантными проростками и проростками дикого типа [16-18].Хотя Болл и др. [17] не обнаружили влияния света на фенотипический вид rax1 на всех стадиях развития, небольшое отставание проростков pad2 , наблюдаемое в условиях низкой освещенности, реверсировалось при ярком свете [22]. Здесь биомасса побегов и PLA cad2 оказались выше, чем у других мутантов с промежуточным содержанием глутатиона. Похожая картина наблюдалась Schnaubelt et al. хотя и не во всех наборах данных последовательно [22]. Эти наблюдения в совокупности подчеркивают, что критически важно применять идеально постоянные условия роста и использовать все мутанты вместе с мутантами дикого типа бок о бок.Действительно, уровни GSH могут значительно различаться между экспериментами из-за некоторых неконтролируемых экспериментальных различий [18]. Использование полной аллельной серии мутантов, выращенных в точно таких же условиях в автоматизированной установке фенотипирования, должно избегать таких ограничений при лабораторном фенотипировании и обеспечивать более надежные данные. Сравнение фенотипов побегов дополнительно подтверждает вывод о том, что фенотипы не коррелируют линейно с содержанием GSH до тех пор, пока содержание GSH может поддерживаться выше определенного порога [20].Возможное объяснение отсутствия линейной корреляции между содержанием глутатиона и ростом может заключаться в том, что доступные мутанты происходят из разных популяций, получавших EMS, которые были проверены на чувствительность к различным стрессовым факторам или стресс-зависимой индукции генов. Это означает, что, несмотря на несколько раундов обратного скрещивания, мутанты могут все еще содержать дополнительные скрытые мутации, которые не связаны с гомеостазом глутатиона. Такие мутации могут влиять на ростовые свойства плейотропным образом, подобно недавним открытиям для мутантов с дефицитом аскорбата [39].В любом случае это дополнительно подчеркивает дополнительную ценность исследования нескольких аллельных мутантов с небольшими отклонениями в GSH, особенно в низком диапазоне GSH, бок о бок.

Нижний порог для поддержания фенотипа дикого типа явно пройден у мутанта zir1 , что приводит к выраженному карликовому изображению [20]. Глутатион — ключевой метаболит, выполняющий важные функции в детоксикации, клеточном окислительно-восстановительном гомеостазе и в качестве кофактора [5,40]. GSH является кофактором в детоксикации метилглиоксаля [41] и переносе кластера Fe-S глутаредоксинами [42].Кроме того, GSH действует как S-донор в биосинтезе глюкозинолатов, а также как совместный субстрат аскорбатпероксидаз и глутатион-S-трансферазы (GST) для детоксикации пероксида и GST для конъюгации электрофильных ксенобиотиков [43–46]. Помимо этого, глутатион является наиболее распространенным низкомолекулярным тиолом с низкими миллимолярными концентрациями в клетке [47] и, как таковой, вместе с глутатионредуктазами важен для поддержания сильно восстанавливающих окислительно-восстановительных потенциалов в цитозоле, пластидах, митохондриях и пероксисомах [10,13,14] .С таким множеством функций неудивительно, что снижение уровня GSH в конечном итоге ухудшает некоторые процессы, даже если это может быть косвенным. Хотя описанные здесь эксперименты не были разработаны для ответа на вопросы о том, какие молекулярные процессы нарушены, результаты, тем не менее, показывают, что необходимо достичь определенного порога истощения GSH, прежде чем рост будет нарушен. Ниже этого порога фенотип развития сильно зависит от концентраций GSH, о чем свидетельствует мутант zir1 , но также мутант rml1 , который имеет менее 5% GSH и останавливается в росте после прорастания [21].Наличие по крайней мере одного жизнеспособного мутанта с низким GSH, который показывает уже сильное и постоянное нарушение роста, кажется особенно полезным для дальнейшей проверки гипотез о причинной связи между содержанием GSH и чувствительностью к стрессу.

Содержание глутатиона и засухоустойчивость

Растения перепрограммируют свой метаболизм и рост при ограничении воды [2], и эти изменения в росте и физиологическом статусе часто можно отслеживать неинвазивно на уровне целых растений [48].Потенциальный квантовый выход фотосинтеза F _v / F _m является параметром функционального состояния фотосистемы II, и хорошо известно, что сильный стресс засухи вызывает снижение F _v / F _m [49, 50]. В то же время также установлено, что F _v / F _m в процессе роста увеличивается с размером листа из-за относительного увеличения листовой пластинки, которая обычно показывает высокие значения F _v / F _m по сравнению с до бордюров с низким значением F _v / F _m [36].Слегка увеличенный F _v / F _m у растений, подверженных умеренному дефициту воды, может, таким образом, соответствовать снижению роста и сопутствующей более ранней дифференциации листьев и, следовательно, более высокой доле листьев с F _v / F _m значениями, типичными для взрослые листья [36]. Аналогичным образом, более низкие значения F _v / F _m для мутантов zir1 в конце периода засухи и все еще после фазы восстановления могут, таким образом, быть следствием задержки развития и менее созревших листьев по сравнению с дикими типами и листьями. все остальные мутанты.Альтернативно, более низкий F _v / F _m со значениями около 0,70–0,71 также может указывать на частичное фотоингибирование в zir1 . Фотоингибирование и сопутствующее производство активных форм кислорода (АФК) — общая черта стрессовых реакций. Учитывая, что GSH участвует в детоксикации ROS через цикл глутатион-аскорбат, фенотип роста, по-видимому, согласуется со снижением роста мутанта с дефицитом аскорбата vtc2-1 [51]. Эта очевидная связь между содержанием аскорбата и ростом растений, однако, недавно была поставлена ​​под сомнение после идентификации и характеристики истинного нулевого аллеля vtc2-4 , который, несмотря на низкое содержание аскорбата, имеет фенотип, подобный дикому типу [39].

Сообщается, что внешняя поставка 400 мкМ GSH делает растения Arabidopsis более засухоустойчивыми [52]. Напротив, мутанты pad2 более чувствительны к засухе, чем растения дикого типа [31]. Однако наши результаты не показывают такой чувствительности к засухе. Вместо этого наш систематический подход скорее указывает на то, что выращенные в почве растения Arabidopsis, подверженные умеренному дефициту воды, обычно реагируют постепенным снижением роста, но без признаков увядания в момент полной остановки роста.На этот ответ не влияет содержание GSH. Это верно даже тогда, когда уровень GSH снижается до 21% от уровней дикого типа, что вызывает серьезную задержку роста zir1 в нестрессовых условиях. Прямое сравнение растений дикого типа и мутантов с уровнями GSH от 62 до 21% по сравнению с диким типом, все они имеют сходные удельные площади листьев, то есть отношения PLA / DW, независимо от того, выращивались ли растения в контрольных условиях или подвергались стрессу засухи. (Рис 5). Временная фаза умеренного дефицита воды, вызванная отсутствием водоснабжения в течение 13 дней, привела к выраженному снижению прироста, но даже небольшому увеличению удельной площади листьев.Этот результат показывает, что растения, испытавшие временный дефицит воды, впоследствии росли немного быстрее, чем контрольные растения, хорошо полившиеся. Повторный рост после повторного полива объясняется увеличением клеток, приводящим к фактическому росту, а не только обратимым изменением из-за повышения тургора [53]. Интересно, что растения, подвергшиеся умеренному стрессу засухи, накапливают сахар и крахмал [54]. Это может способствовать быстрому возобновлению роста после повторного полива на всех линиях, включая zir1 .В этом контексте важно наблюдение, что линейность для конкретной площади листа у всех мутантов и дикого типа сохраняется, что указывает на то, что даже мутант zir1 с очень низким содержанием глутатиона не получил серьезных повреждений во время стрессовой обработки.

Заключение

Наш анализ дает систематическое количественное основание для наблюдения, что дефицит глутатиона вызывает задержку роста как корней, так и побегов. Прямое параллельное сравнение мутантов с разной степенью истощения глутатиона показывает не постепенное снижение роста, а незначительное замедление у мутантов с 25–62% GSH и более тяжелое только для мутантов с только 21% GSH.Это говорит о том, что в нестрессовых условиях частичное истощение пула клеточного глутатиона допустимо, в то время как превышение порога ниже примерно 25% GSH приводит к постепенному ухудшению роста растений.

Наш систематический анализ не показал никаких признаков того, что содержание глутатиона в растениях Arabidopsis коррелирует с засухоустойчивостью. Это подтверждает недавний метаанализ опубликованных данных, приведший к выводу, что устойчивость к засухе более вероятно связана с повышенным уровнем аскорбат-зависимой антиоксидантной способности, чем с ответом тиол-окислительно-восстановительной сети [55].Умеренный дефицит воды, вызванный забором воды до прекращения роста побегов, показал, что растения дикого типа и все мутанты реагировали одинаково с точки зрения всех проанализированных морфологических параметров, а также фотосинтетического аппарата, проанализированного с помощью флуоресценции хлорофилла. Взятые вместе, результаты показывают, что глутатион важен для общей продуктивности растений, но не влияет на устойчивость к умеренным засушливым условиям, обычно испытываемым полевыми культурами. Однако засушливые условия в поле обычно сопровождаются другими стрессовыми факторами, такими как высокая интенсивность света.Таким образом, будущая работа также должна будет изучить реакцию мутантов с дефицитом глутатиона на комбинаторные стрессы.

Дополнительная информация

S1 Рис. Длительный осмотический стресс вызывает частичное окисление цитозольного Grx1-roGFP2 в проростках арабидопсиса.

( A ) Семядоли 9-дневных проростков переносили на 300 мМ маннитола на 5 день после прорастания. ( B ​​) 5-дневные проростки переносили на 300 мМ маннита. Пунктирные горизонтальные линии показывают значения соотношения, полученные в результате обработки 10 мМ DTT для полного восстановления (синий) и 25 мМ H ₂ O ₂ для полного окисления (красный).( C ) 5-дневные проростки проросли и непрерывно выращивали на 300 мМ манните. Все значения являются средними значениями ± стандартное отклонение ( n ≥ 10). Буквы указывают на существенные различия (односторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Тьюки; p ≤ 0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220589.s001

(PDF)

S2 Рис. Сухая масса побегов и содержание воды в побегах для мутантов дикого типа и

( A , C ) Сухая масса побегов для хорошо поливаемых контрольных растений ( A ) и растений, подверженных стрессу засухи ( C ).( B ​​, D ) содержание воды в побегах под контролем ( B ​​) и в условиях засухи ( D ). Значения представляют собой средние значения ± стандартное отклонение ( n ≥ 10). Буквы на каждом графике указывают на значимые различия (односторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Тьюки; p <0,05).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0220589.s002

(PDF)

Благодарности

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках исследовательской учебной группы GRK 2064 (AM; MS; SJM-S), грант ME1567 / 9-1 / 2 в рамках приоритетной программы SPP1710 (AM), программы Emmy-Noether (SCHW1719 / 1-1; MS) и Excellence Initiative (EXC 1028; SK).Благодарим CoSens за грант Фонда посевов от Научного центра биоэкономики, NRW (AM; MS). Научная деятельность Научного центра биоэкономики финансируется Министерством инноваций, науки и исследований в рамках NRW Strategieprojekt BioSC (№ 313 / 323-400-002 13). SB получил финансовую поддержку в виде стипендии Комиссии высшего образования Пакистана. Предоставление мутантных семян Крисом Коббеттом ( rml1 и cad2 ), Филом Муллино ( rax1 ), Феликсом Маухом ( pad2 ), Джулианом Шредером ( nrc1 ) и Куо-Чен Йе1 () .Мы благодарим Bastian Welter (Кельнский университет) за техническую помощь с измерениями HPLC, Silvia Braun и Thorsten Brehm (FZ Jülich) за поддержку экспериментов по фенотипированию побегов и стресса засухи, а также доктора Kerstin Nagel за обсуждение подходов к фенотипированию и критическое чтение рукопись.

Список литературы

1. 1. Ян С., Вандербельд Б., Ван Дж., Хуанг Ю. Сужение целей: к успешной генной инженерии устойчивых к засухе сельскохозяйственных культур.Завод Мол. 2010; 3: 469–490. pmid: 20507936
2. 2. Клэйс Х., Инзе Д. Мучение выбора: как растения уравновешивают рост и выживание в условиях ограничения воды. Plant Physiol. 2013; 162: 1768–1779. pmid: 23766368
3. 3. Слэттери Р.А., Эйнсворт Э.А., Орт Д.Р. Мета-анализ реакции эффективности фотосинтетического преобразования растительного покрова на факторы окружающей среды выявил основные причины разницы в урожайности. J Exp Bot. 2013; 64: 3723–3733. pmid: 23873996
4. 4. Деринг Д., Конвей Д., Раманкутти Н., Прайс Дж., Уоррен Р.Глобальная реакция урожайности на экстремальный тепловой стресс в условиях будущего изменения климата. Environ Res Lett. 2014; 9: 034011.
5. 5. Noctor G, Mhamdi A, Chaouch S, Han Y, Neukermans J, Marquez-Garcia B и др. Глутатион в растениях: комплексный обзор. Plant Cell Environ. 2012; 35: 454–484. pmid: 21777251
6. 6. Петров В.Д., Ван Брезегем Ф. Перекись водорода — центральный узел информационного потока в клетках растений. ЗАВОДЫ AoB. 2012; 2012: pls014.
7. 7.Xie X, He Z, Chen N, Tang Z, Wang Q, Cai Y. Роль факторов окружающей среды в регуляции окислительного стресса у растений. BioMed Res Int. 2019; 2019: 9732325. pmid: 31205950
8. 8. Noctor G, фойе CH. Аскорбат и глутатион: удержание активного кислорода под контролем. Annu Rev Plant Biol. 1998; 49: 249–279.
9. 9. Меландри Г., Абдельгавад Х., Рив Д., Хагеман Дж. А., Асард Х., Бемстер ГТС и др. Биомаркеры стабильности урожайности зерна риса в условиях стресса засухи.J Exp Bot. 2019; Скоро. pmid: 31087074
10. 10. Марти Л., Сиала В., Шварцлендер М., Фрикер М.Д., Виртц М., Sweetlove LJ и др. НАДФН-зависимая тиоредоксиновая система представляет собой функциональную резервную копию цитозольной глутатионредуктазы у Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci-USA. 2009; 106: 9109–9114. pmid: 19451637
11. 11. Mhamdi A, Hager J, Chaouch S, Queval G, Han Y, Taconnat L, et al. Arabidopsis GLUTATHIONE REDUCTASE1 играет решающую роль в ответах листьев на внутриклеточный перекись водорода и в обеспечении соответствующей экспрессии генов через сигнальные пути салициловой кислоты и жасмоновой кислоты.Plant Physiol. 2010; 153: 1144–1160. pmid: 20488891
12. 12. Мейер А.Дж. Интеграция гомеостаза глутатиона и редокс-сигналов. J. Plant Physiol. 2008; 165: 1390–1403. pmid: 18171593
13. 13. Мейер А.Дж., Брач ​​Т., Марти Л., Край С., Руйе Н., Жако Дж-П и др. Редокс-чувствительный GFP в Arabidopsis thaliana является количественным биосенсором окислительно-восстановительного потенциала клеточного глутатионового окислительно-восстановительного буфера. Плант Дж. 2007; 52: 973–986. pmid: 178

    ---

14. 14.Шварцлендер М., Фрикер М., Мюллер С., Марти Л., Брах Т., Новак Дж. И др. Конфокальная визуализация окислительно-восстановительного потенциала глутатиона в живых растительных клетках. J Microsc-Oxford. 2008; 231: 299–316.
15. 15. Jez JM, Cahoon RE, Chen S. Arabidopsis thaliana Функциональные свойства глутамат-цистеинлигазы, кинетический механизм и регуляция активности. J Biol Chem. 2004; 279: 33463–33470. pmid: 15180996
16. 16. Хауден Р., Андерсен ЧР, Голдсбро ПБ, Коббетт CS.Кадмий-чувствительный мутант с дефицитом глутатиона Arabidopsis thaliana . Plant Physiol. 1995; 107: 1067–1073. pmid: 7770518
17. 17. Ball L, Accotto G-P, Bechtold U, Creissen G, Funck D, Jimenez A и др. Доказательства прямой связи между биосинтезом глутатиона и экспрессией гена защиты от стресса у Arabidopsis. Растительная клетка. 2004; 16: 2448–2462. pmid: 15308753
18. 18. Паризи V, Пуансо Б., Овсяновски Л., Бухала А., Глейзбрук Дж., Маух, Ф.Идентификация PAD2 как γ-глутамилцистеинсинтетазы подчеркивает важность глутатиона в устойчивости Arabidopsis к болезням. Плант Дж. 2007; 49: 159–172. pmid: 17144898
19. 19. Джобе Т.О., Сунг Д.Й., Акмакджян Дж., Фам А., Комивес Е.А., Мендоза ‐ Козатль Д.Г. и др. Ингибирование обратной связи тиолами превосходит истощение глутатиона: скрининг на основе люциферазы выявляет дефицитные по глутатиону γ-ECS и мутанты глутатионсинтетазы, нарушенные в индуцированной кадмием ассимиляции сульфата. Завод Дж.2012; 70: 783–795. pmid: 22283708
20. 20. Шанмугам В., Цедни М., Йе К.С. Толерантность к цинку, индуцированная железом 1 показывает важность глутатиона в перекрестном гомеостазе между цинком и железом у Arabidopsis thaliana . Plant J. 2012; 69: 1006–1017. pmid: 22066515
21. 21. Vernoux T, Wilson RC, Seeley KA, Reichheld J.P., Muroy S, Brown S и др. Ген ROOT MERISTEMLESS1 / CADMIUM SENSITIVE2 определяет глутатион-зависимый путь, участвующий в инициации и поддержании клеточного деления во время постэмбрионального развития корня.Растительная клетка. 2000; 12: 97–109. pmid: 10634910
22. 22. Schnaubelt D, Schulz P, Hannah MA, Yocgo RE, Foyer CH. Феномический подход к анализу влияния глутатиона на площадь листа и устойчивость к абиотическому стрессу у Arabidopsis thaliana . Фронтальный завод им. 2013; 4: 416. pmid: 24204368
23. 23. Pei Z-M, Murata Y, Benning G, Thomine S. Кальциевые каналы, активируемые перекисью водорода, опосредуют передачу сигналов абсцизовой кислоты в замыкающих клетках. Природа. 2000; 406: 731–734.pmid: 10963598
24. 24. Murata Y, Mori IC, Munemasa S. Разнообразная устьичная передача сигналов и механизм интеграции сигналов. Annu Rev Plant Biol. 2015; 66: 369–392. pmid: 25665132
25. 25. Карпинская Б, Аломрани С.О., Фойе СН. Ингибитор-индуцированное окисление ядра и цитозоля в Arabidopsis thaliana : последствия для ретроградной передачи сигналов от органелл к ядру. Фил Т. Р. Соц Б. 2017; 372: 20160392.
26. 26. Мейер А.Дж., Дик Т.П.Флуоресцентные окислительно-восстановительные зонды на белковой основе. Знак антиоксидантного окислительно-восстановительного потенциала. 2010; 13: 621–650.
27. 27. Шварцлендер М., Дик Т.П., Мейер А.Дж., Морган Б. Анализ окислительно-восстановительной биологии с использованием флуоресцентных белковых сенсоров. Знак антиоксидного окислительно-восстановительного потенциала. 2016; 24: 680–712.
28. 28. Schwarzländer M, Fricker MD, Sweetlove LJ. Мониторинг окислительно-восстановительного состояния митохондрий растений in vivo: эффект респираторных ингибиторов, абиотический стресс и оценка восстановления после окислительной нагрузки. ББА-Биоэнергетика.2009; 1787: 468–475. pmid: 19366606
29. 29. Jubany-Mari T, Alegre-Batlle L, Jiang K, Feldman L. Использование GFP, чувствительного к окислению-восстановлению (c-roGFP1), для мониторинга окислительно-восстановительного статуса цитозоля в реальном времени у растений Arabidopsis thaliana , испытывающих водный стресс. FEBS Lett. 2010; 584: 889–897. pmid: 20079738
30. 30. Кумар Д., Датта Р., Синха Р., Гош А., Чаттопадьяй С. Протеомное профилирование γ-ECS сверхэкспрессируемой трансгенной Nicotiana в ответ на стресс засухи. Сигнальное поведение растений.2014; 9: e29246. pmid: 25763614
31. 31. Ченг М.С., Ко К., Чанг В.Л., Куо В.С., Чен Г.Х., Линь Т.П. Повышенный уровень глутатиона способствует устойчивости к стрессу и глобальным трансляционным изменениям Arabidopsis. Plant J. 2015; 83: 926–939. pmid: 26213235
32. 32. Джубани-Мари Т., Михан С., Лопес-Карбонелл М., Алегре Л. Дефицит глутатиона у растений Arabidopsis thaliana pad2-1 не влияет на реакцию дефицита воды. Am J Plant Sci. 2016; 7: 2020.
33. 33.Schnaubelt D, Queval G, Dong Y, Diaz-Vivancos P, Makgopa ME, Howell G и др. Низкий уровень глутатиона регулирует экспрессию генов и окислительно-восстановительные потенциалы ядра и цитозоля Arabidopsis thaliana . Plant Cell Environ. 2015; 38: 266–279. pmid: 24329757
34. 34. Лоулор DW. Генная инженерия для улучшения продуктивности растений в условиях засухи: физиологическая оценка достижений, ограничений и возможностей. J Exp Bot. 2013; 64: 83–108. pmid: 23162116
35. 35.Харб А., Кришнан А., Амбаварам MMR, Перейра А. Молекулярный и физиологический анализ стресса от засухи у Arabidopsis показывает ранние реакции, ведущие к акклиматизации в росте растений. Plant Physiol. 2010; 154: 1254–1271. pmid: 20807999
36. 36. Янсен М., Гилмер Ф., Бискуп Б., Нагель К.А., Рашер Ю., Фишбах А. и др. Одновременное фенотипирование роста листьев и флуоресценции хлорофилла с помощью GROWSCREEN FLUORO позволяет выявить стрессоустойчивость у Arabidopsis thaliana и других розеточных растений.Funct Plant Biol. 2009; 36: 902–914.
37. 37. Барбоза-Баркеро Л., Нагель К.А., Янсен М., Класен Дж. Р., Кастенхольц Б., Браун С. и др. Фенотип полукарликов Arabidopsis thaliana с глубокими корнями и высокой скоростью роста в условиях ограничения воды не зависит от аллелей потери функции GA5. Энн Бот-Лондон. 2015; 116: 321–331.
38. 38. Фрикер MD. Программное обеспечение для количественной обработки изображений окислительно-восстановительного потенциала. Знак антиоксидного окислительно-восстановительного потенциала. 2016; 24: 752–762.
39. 39. Лим Б., Смирнов Н., Коббет С.С., Гольц Дж. Ф.Мутанты vtc2 с дефицитом аскорбата у Arabidopsis не демонстрируют снижения роста. Фронтальный завод им. 2016; 7: 1025. pmid: 27468291
40. 40. Депонте М. Неполная загадка глутатиона: просто угадывать числа и цифры? Знак антиоксидного окислительно-восстановительного потенциала. 2017; 27: 1130–1161.
41. 41. Соуза Сильва М., Гомеш Р.А., Феррейра А.Э., Понсес Фрейре А., Кордейро С. Путь глиоксалазы: первые сто лет… и далее. Биохим Дж. 2013; 453: 1–15. pmid: 23763312
42. 42.Мозелер А., Аллер I, Вагнер С., Ницель Т., Пшибила-Тоскано Дж., Мюленхофф У. и др. Митохондриальный монотиол глутаредоксин S15 необходим для созревания железо-серного белка у Arabidopsis thaliana . P Natl Acad Sci-USA. 2015; 112: 13735–13740.
43. 43. Геу-Флорес Ф., Нильсен М.Т., Нафиси М., Молдруп М.Э., Олсен К.Э., Мотавиа М.С. и др. Глюкозинолатная инженерия идентифицирует гамма-глутамилпептидазу. Nat Chem Biol. 2009; 5: 575–577. pmid: 19483696
44. 44.Диксон Д.П., Лапторн А., Эдвардс Р. Трансферазы глутатиона растений. Genome Biol. 2002; 3: 3004.
45. 45. Labrou NE, Papageorgiou AC, Pavli O, Flemetakis E. Plant GSTome: структура и функциональная роль в сети ксенома и реакции растений на стресс. Curr Opin Biotechnol. 2015; 32: 186–194. pmid: 25614070
46. 46. Foyer CH, Noctor G. Аскорбат и глутатион: сердце окислительно-восстановительного узла. Plant Physiol. 2011; 155: 2–18. pmid: 21205630
47. 47. Мейер А.Дж., Мэй М.Дж., Фрикер М.Количественное измерение глутатиона в клетках Arabidopsis in vivo. Plant J. 2001; 27: 67–78. pmid: 11489184
48. 48. Фиорани Ф., Шурр У. Будущие сценарии фенотипирования растений. Annu Rev Plant Biol. 2013; 64: 267–291. pmid: 23451789
49. 49. Ву Н., Бэджер М., Погсон Б. Быстрая неинвазивная процедура количественной оценки выживаемости в засухе с использованием флуоресценции хлорофилла. Plant Meth. 2008; 4:27.
50. 50. Спердули I, Мустакас М.Пространственно-временная неоднородность в листьях Arabidopsis thaliana при стрессе засухи. Plant Biol. 2012; 14: 118–128. pmid: 21972900
51. 51. Мюллер-Муле П., Голан Т., Нийоги К.К. Мутанты Arabidopsis с дефицитом аскорбата растут при ярком освещении, несмотря на хронический фотоокислительный стресс. Plant Physiol. 2004; 134: 1163–1172. pmid: 14963245
52. 52. Чен Дж.Х., Цзян Х.В., Се Э.Д., Чен Х.Й., Чиен С.-Т, Се Х.-Л и др. Устойчивость к засухе и солевому стрессу нокаут-мутанта U17 глутатиона S-трансферазы Arabidopsis объясняется комбинированным действием глутатиона и абсцизовой кислоты.Plant Physiol. 2012; 158: 340–351. pmid: 22095046
53. 53. Lechner L, Pereyra-Irujo GA, Granier C, Aguirrezábal LAN. Повторное увлажнение растений после длительной обработки в условиях дефицита воды показывает, что эпидермальные клетки листа сохраняют свою способность к расширению после того, как лист, по-видимому, достиг своего окончательного размера. Энн Бот-Лондон. 2008; 101: 1007–1015.
54. 54. Скирич А., Инзе Д. Больше из меньшего: рост растений в условиях ограниченного количества воды. Curr Opin Biotechnol. 2010; 21: 197–203. pmid: 20363612
55. 55.Laxa M, Liebthal M, Telman W, Chibani K, Dietz KJ. Роль антиоксидантной системы растений в засухоустойчивости. Антиоксиданты. 2019; 8:94.

Ацетилирование консервативных лизинов регулирует активность митохондриальной малатдегидрогеназы у наземных растений.

Введение

Поток через центральный метаболизм особенно динамичен у растений и может резко меняться в ответ на изменения внешних условий или внутренних требований. Например, цикл трикарбоновой кислоты (TCA), который локализован в митохондриях, может работать в циклическом или нециклическом режиме в зависимости от типа клетки и требований к снижению мощности, АТФ и углеродного скелета (Sweetlove et al., 2010). Хотя декарбоксилирование пирувата в результате гликолиза считается основной точкой входа углерода в цикл TCA у большинства организмов, в тканях зеленых растений именно малат, а не пируват, в большинстве случаев выступает в качестве основного субстрата для цикла TCA (Sweetlove и др., , 2010). Митохондриальная малатдегидрогеназа (mMDH; EC 1.1.1.37) взаимно превращает малат и оксалоацетат (OAA), используя NAD ⁺ / NADH в качестве вспомогательного субстрата. In vivo направление реакции зависит от потребностей клеток и окислительно-восстановительного состояния пула НАД в матрице (рис.1). Помимо своей классической роли в поддержке потока цикла TCA для генерации OAA из малата для дыхания, mMDH обеспечивает OAA для синтеза аспартата и — косвенно — цитрата в качестве предшественника для ассимиляции азота (рис.1) (Hanning and Heldt, 1993 , Sweetlove и др. , 2010). В частности, в освещенных листьях мМДГ может также поддерживать метаболический поток в противоположном направлении для окисления НАДН до НАД ⁺ для потребления фотодыхательной глициндекарбоксилазой (Journet et al., 1981), и как часть митохондриального малатного клапана, который связывает окислительно-восстановительные состояния пулов NAD митохондриального матрикса и цитозоля посредством обмена малата и OAA (рис.1) (Scheibe, 2004, Scheibe et al. , 2005, Sweetlove и др. , 2010). Все эти аспекты митохондриального метаболизма подтверждаются моделями, полученными с помощью анализа баланса потока диэлемента (Shameer et al. , 2019).

Мы выровняли белковые последовательности мМДГ этих шести видов с мМДГ модельных растений, представляющих различные основные клады наземных растений (папоротники: Azolla filiculoides и Salvinia cucullata ; роголистник: Anthoceros agrestis , печеночники и polymorpha Marpha . зеленые водоросли: Chlamydomonas reinhardtii ), в том числе P.patens как модельный мох и A. thaliana как модельное цветущее растение. Последовательности идентифицировали с помощью Blast, используя A. thaliana mMDh2 в качестве запроса. Для выбранных модельных видов мы идентифицировали кластеризацию белков MDH вместе с mMDH A. thaliana и P. patens в филогенетических анализах (вспомогательный рис. S1). Пероксисомальные и хлоропластные MDH A thaliana и P. patens сгруппированы в отдельные клады. Для сравнения мы включили E.coli MDH и mMDh3 человека вместе с их известными сайтами ацетилирования лизина (Zhao et al. , 2010, Schilling et al. , 2015) в выравнивании последовательностей (рис. 3). Последовательности в выравнивании группируются на основе филогении наземных растений (Qiu et al. , 2006, Bremer et al. , 2009). Только для Oryza sativa были идентифицированы разные сайты ацетилирования в обоих паралогах мМДГ, и, таким образом, оба белка были включены в выравнивание (Zhao et al., 2010, He et al. , 2016) (рис.3).

Интересная картина возникает для двух соседних остатков лизина в последовательностях мМДГ, которые соответствуют K169 и K170 в последовательности A. thaliana (рис. 3). В различных исследованиях было обнаружено, что эти остатки лизина ацетилированы в мМДГ нескольких видов растений. K172 из P. patens mMDh2 (соответствует K169 из A. thaliana ), идентифицированный с высоким охватом в нашем ацетиломе P. patens , также был ацетилирован в mMDh2 из Camellia (Jiang et al., 2018) и Brachypodium (Zhen et al. , 2016) и в mMDh3 листьев O. sativa (Zhou et al. , 2018). K170 из A. thaliana mMDh2 также был ацетилирован в mMDh2 листьев клубники (Fang et al. , 2015) и экзокарпа виноградной лозы (Melo-Braga et al. , 2012) и в mMDh3 из O. sativa (He et al. , 2016) (рис.3). В mMDh3 риса лизины в положениях 169 и 170 были идентифицированы как дифференциально ацетилированные в разных органах.Другие покрытосеменные в этом наборе данных показали ацетилирование только одного или другого лизина (рис. 3).

Интересно, что в положениях, соответствующих K169 и K170 в A. thaliana , все другие исследованные виды обнаруживают либо лизин, либо аргинин; последний по структуре и химическим свойствам аналогичен неацетилированному лизину. Даже в пластидных и пероксисомных MDH A. thaliana и P. patens в этих двух положениях присутствует лизин или аргинин (вспомогательная таблица S4).Пероксисомальный MDh2 из A. thaliana имеет общий сайт ацетилирования с mMDh2 из P. patens (подтверждающий рис. S1, подтверждающий стол S4, (König et al. , 2014a)). Однако в MDH E. coli и MDH человека позиция 169 занята аспарагином, который частично имитирует постоянно ацетилированный лизин. Другими ацетилированными лизинами в мМДh2 A. thaliana являются K325, K329 и K334 (König et al. , 2014a), каждый из которых, как было обнаружено, ацетилирован по крайней мере в одном другом виде покрытосеменных.Ацетилированный K325 был обнаружен у V. vinifera , а ацетилированный K329 и K334 — у O. sativa mMDh3 и mMDh2 соответственно (рис. 3). Кроме того, K329 был идентифицирован как ацетилированный в E. coli MDH (фиг. 3).

Ферментативные свойства сайт-специфических ацетилированных

Сохранение сайтов ацетилирования лизина в растительных мМДГ (рис. 3) побудило нас исследовать влияние ацетилирования на ферментативные свойства фермента в модельных растениях A.thaliana и P. patens . Мы избирательно включаем ацетил-лизин (AcK) в лизины K170, K325, K329 и K334 mMDh2 A. thaliana (König et al. , 2014a), а также K172 mMDh2 из P. Patens . (Таблица 1, рис. 3, вспомогательные таблицы S2 и S3). Ацетилирование лизина было включено в рекомбинантно экспрессируемые белки с использованием системы подавления янтаря в E. coli , которая позволяет ко-трансляционному добавлению N-ацетиллизина в ответ на стоп-кодон в желаемых положениях (Neumann et al., 2008, Neumann et al. , 2009 г.). A. thaliana и P. Patens немодифицированный mMDh2 и варианты белка, несущие одиночные ацетилированные лизины, были экспрессированы в E. coli в присутствии N-ацетиллизина и никотинамида (для ингибирования E. coli деацетилазы CobB) и очищают до гомогенности (фиг. 4A). Во всех случаях были получены белки с ожидаемой молекулярной массой (33,5 кДа для A. thaliana и 36 кДа для P.патенты ; Рис. 4A). Включение AcK в желаемые положения A. thaliana и P. Patens мМДh2 было подтверждено с помощью ЖХ-МС / МС (вспомогательная таблица S6).

Влияние ацетилирования лизина на активность мМДГ. A. SDS-PAGE, окрашенный кумасси выделенного рекомбинантного немодифицированного (обозначенного как WT) и ацетилированного лизином (AcK) вариантов P. patens ( Pp ) и A. thaliana ( At ). ) мМДх2.Слева маркеры молекулярной массы (Spectra Multicolor Wide Range Protein Ladder; ThermoFisher Scientific). B. Кинетические параметры восстановления OAA и окисления малата рекомбинантными немодифицированными (обозначенными как WT) и AcK версиями A. thaliana и P. patens мМДх2. Данные были скорректированы по уравнению Михаэлиса-Ментен нелинейной регрессией с помощью Prism 6 (программное обеспечение GraphPad). Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение; n = по крайней мере три независимых ферментных препарата, каждый из которых измерен в трех экземплярах. * обозначает значения, которые статистически значимо отличаются от соответствующего WT, оцененного с помощью непарного t-критерия. Полученные p-значения указаны в скобках под оцененными значениями. C. Native PAGE рекомбинантных немодифицированных (WT) и лизин-ацетилированных (AcK) вариантов P. patens ( Pp ) и A. thaliana ( At ) mMDh2. Положение маркеров молекулярной массы (Sigma Aldrich) ß-амлиазы (200 кДа), алкогольдегидрогеназы (150 кДа) и бычьего сывороточного альбумина (66 кДа) показано слева.

Затем мы определили кинетические параметры in vitro очищенного рекомбинантного немодифицированного mMDh2 и одноцентровых ацетилированных версий. Во-первых, мы сосредоточились на направлении снижения OAA, и в этом случае активность mMDH необходима преимущественно для продуцирования малата для его транслокации в цитозоль для восстановления окислительно-восстановительного баланса (рис. 1D). Мы обнаружили, что ацетилирование в положениях K325 и K329 в мМДh2 A. thaliana не оказало значительного влияния на кинетические параметры фермента.Напротив, ацетилирование по K334 уменьшало число оборотов ( k _cat ) до 64,4% немодифицированного фермента. Ацетилирование по K170 уменьшало число оборачиваемости до 37% при увеличении сродства к OAA (уменьшая K _m ) до 50% немодифицированного фермента. Тот же анализ с P. Patens mMDh2 показал, что ацетилирование в K172 удваивает число оборотов по сравнению с немодифицированным ферментом (рис. 4B) с соответствующим увеличением каталитической эффективности ( k _cat / К _м = 23.7 ± 3,7 мкМ ⁻¹ с ⁻¹ ) по сравнению с немодифицированным ферментом ( K _cat / K _m = 14,8 ± 2,3 мкМ ⁻¹ с ⁻¹ ) .

Далее мы проанализировали активность мМДГ в его респираторной роли в цикле TCA, в котором OAA генерируется в результате окисления малата (рис. 1). Мы обнаружили, что ацетилирование всех проанализированных одиночных аминокислотных позиций в мМДh2 A. thaliana влияет на ферментативные параметры. Ацетилирование в положении K170 снижает сродство к малату до 65% по сравнению с немодифицированным ферментом (рис.4Б). Как следствие, ацетилирование K170 снижает каталитическую эффективность ( K _cat / K _m = 0,27 ± 0,05 мкМ ^-1 с ^-1 ) до 67,5% немодифицированного фермента ( K _cat / K _m = 0,40 ± 0,04 мкМ ⁻¹ с ⁻¹ ). Ацетилирование в положениях K325, K329 и K334 в мМДh2 A. thaliana снижает число оборота до 76-79% по сравнению с немодифицированным ферментом, одновременно увеличивая сродство к малату (уменьшенные значения K _m , рис. .4B) на 15%, 24% и 74% соответственно по сравнению с немодифицированным ферментом (рис. 4B). Изменение кинетических параметров ацетилированного mMDh2 на K334 приводит к 3-кратному увеличению каталитической эффективности ( K _cat / K _m = 1,34 ± 0,56 мкМ ^-1 с ^-1 ). Напротив, каталитическая эффективность двух других ферментных вариантов, несущих ацетилирование по K325 ( K _cat / K _m = 0.37 ± 0,05 мкМ ⁻¹ с ⁻¹ ) и у K329 ( K _cat / K _м = 0,40 ± 0,08 мкМ ⁻¹ с ⁻¹ ) были аналогичны немодифицированного фермента. Ацетилирование P. Patens мМДч2 в K172 не влияло на ферментативные параметры в направлении окисления малата по сравнению с немодифицированным ферментом (фиг. 4B).

Остатки лизина, соответствующие K172 MDh2 из P. patens , также были обнаружены ацетилированными у трех видов покрытосеменных (Zhen et al., 2016, Цзян и др. , 2018, Чжоу и др. , 2018). Мы дополнительно исследовали потенциальную консервативную регуляторную роль этого остатка лизина в мМДh2 A. thaliana . Мы получили рекомбинантный мМДГ A. thaliana AcK169 (соответствующий K172 в P. Patens ) и оценили его кинетические параметры в обоих направлениях реакции. Мы обнаружили, что, как и в случае P. patens, ацетилирование mMDh2 Arabidopsis в K169 не оказало значительного влияния на кинетические параметры фермента в реакции окисления малата.Напротив, в направлении уменьшения OAA ацетилирование по K169 снижает сродство Arabidopsis mMDh2 к OAA в 2,3 раза ( K _m = 39 ± 8 мкМ ^-1 ; p = <0,0001 ) с соответствующим снижением каталитической эффективности ( K _cat / K _m = 15 ± 6 мкМ ^-1 с ^-1 ; p = 0,0027) по сравнению с не- модифицированный фермент (рис. 4В).

Анализ подвижности ацетилированных белков с помощью нативного PAGE

Введение PTM может вызвать изменения в структурных характеристиках белка, которые могут повлиять на кинетические свойства.Чтобы проанализировать, сохраняется ли общая организация немодифицированных ферментов в полученных одиночных ацетилированных рекомбинантных вариантах мМДГ, мы сравнили подвижность ферментов в нативном гель-электрофорезе. Выделенные белки обрабатывали бок о бок на одном и том же геле и анализировали на активность MDH.

Мы обнаружили, что в гомогенном нативном ПААГ рекомбинантный mMDh2 из A. thaliana и P. patens присутствует в виде отдельных полос, весьма вероятно соответствующих димерам (рис.4D). A. thaliana и P. Patens белки mMDh2 незначительно различаются по своей подвижности, что, вероятно, связано с различиями в молекулярных массах субъединиц (рис. 4A) и различных общих форм белков, которые могут быть приняты в растворе. Результаты нативного PAGE демонстрируют, что все ацетилированные версии mMDh2 A. thaliana и P. patens сохраняют те же структуры олигомеров, которые наблюдаются в немодифицированных белках (рис. 4C), что указывает на то, что обнаруженные изменения активности не могут быть объяснены. изменениями в гомомеризации.

Картирование сайтов ацетилирования на кристаллических структурах MDH

Мы использовали кристаллические структуры MDH E. coli, (PDB ID: 1EMD) и MDh3 человека (PDB ID: 2DFD), чтобы выполнить моделирование гомологии A. thaliana и P. Patens структур и картировать остатки ацетилированного лизина, проанализированные в этом исследовании, на молекулярные структуры. Модели мономеров, димеров и тетрамеров мМДГ2 A. thaliana и P. Patens показывают, что ни один из остатков ацетилированного лизина не находится в непосредственной близости от активного центра (рис.5A-B), ни димеров или тетрамеров, предсказанных построенными моделями (рис. 5C-F).

Ацетилирование остатков лизина является особенно распространенной посттрансляционной модификацией митохондриальных и пластидных протеомов (Lombard et al. , 2007, König , 2014, König et al. Смит-Хаммонд и др. , 2014, Хартл и др. , 2017). Нами обнаружено 324 сайта ацетилирования лизина в органеллярных белках гаметофора P. patens .Поскольку ацетилирование лизина является высокодинамичной модификацией и его возникновение зависит от метаболического статуса организма (Meyer et al. , 2018), паттерн ацетилирования может различаться для разных стадий развития, органов и условий роста. Чтобы уменьшить влияние такой внутриорганической изменчивости, мы стремились рассмотреть аналогичные ткани для сравнения между A. thaliana и P. patens . Митохондриальные белки были особенно широко представлены среди белков, ацетилированных лизином, обнаруженных у P.патент , даже больше, чем в недавних исследованиях ацетилома цельной ткани A. thaliana (Hartl et al.2017, Uhrig et al.2019). Количество 82 митохондриальных белков, идентифицированных здесь из целых гаметофоров P. patens , в целом соответствует 120 лизин-ацетилированным белкам, которые были обнаружены в изолированных митохондриях A. thaliana проростков (König et al. , 2014a).

Из-за отсутствия доказательств наличия митохондриальной ацетилтрансферазы в растениях кажется вероятным, что ацетилирование митохондриального белка в основном происходит неферментативно между ацетил-КоА и специфическими остатками лизина с особенно высокой реактивностью.Функциональный устойчивый паттерн ацетилирования лизина, вероятно, устанавливается ферментативно контролируемым деацетилированием, которое осуществляется сиртуиновыми белками (Lombard et al. , 2007, König et al. , 2014b, Anderson et al. , 2017). Как правило, ацетилирование лизина снимает положительный заряд с лизиновых боковых цепей белков, увеличивая их гидрофобность. Однако, подобно фосфорилированию, ацетилирование лизина может влиять на функцию белка по-разному, и оно может вызывать активацию, а также ингибирование ферментов в зависимости от функции конкретного остатка лизина в структуре белка (Hosp et al., 2017).

Хотя одни и те же митохондриальные белки часто обнаруживаются ацетилированными у разных видов покрытосеменных, расположение конкретных ацетилированных лизинов в белке часто отличается (Finkemeier et al. , 2011, Hosp et al. , 2017). Наше исследование показывает, что это верно даже для филогении наземных растений. Мы обнаружили те же самые митохондриальные белки, ацетилированные у отдаленных видов наземных растений P. patens и A. thaliana (всего было идентифицировано 22 группы ортологичных белков) и обнаружили, что большинство (66%) позиций лизина, которые были ацетилированы в митохондриальные белки A.thaliana или P. patens сохранялась и в ортологах других видов (вспомогательная таблица S4). Однако даже в цикле TCA или в белках PDC, которые показали высокое ацетилирование как в P. patens , так и в A. thaliana (до 4 ацетилированных лизинов), было совместным только небольшое количество сайтов ацетилирования (всего два). между ортологами двух видов. Причиной ограниченного количества обнаруженных общих остатков ацетилированного лизина может быть выраженная динамика (де-) ацетилирования лизина, так что каждое экспериментальное условие может обнаруживать только подмножество физиологически релевантных ацетилирований.Известно, что ферменты цикла TCA регулируются обратимым ацетилированием в клетках бактерий и млекопитающих в зависимости от статуса питания, а также от циркадных часов (Wang et al. , 2010, Masri et al. , 2013, Мейер и др. , 2018). В то время как ограничения калорийности обычно приводят к деацетилированию, питание с сахаром приводит к сильному увеличению митохондриального ацетилирования всех ферментов цикла ТЦА (Meyer et al. , 2018).

остатков лизина, соответствующих K170 в A.thaliana mMDh2, ацетилирование которого приводило к изменению каталитических параметров фермента, было обнаружено ацетилированным у трех других видов, а также в других условиях. То же самое наблюдалось для сайта K172 MDh2 P. patens ; соответствующие остатки лизина были также ацетилированы у трех видов покрытосеменных. Обнаружение гомологичных ацетилированных лизинов у отдаленных видов подчеркивает, что ПТМ, скорее всего, будут играть физиологически значимую роль в регуляции метаболизма.

Ацетилирование лизинов в консервативной горячей точке модулирует активность MDH растений

В дополнение к идентификации ацетилирования MDH E. coli и mMDh3 человека (Venkat et al. , 2017) недавние протеомные исследования сообщают об ацетилировании растений. белки мМДГ, хотя и в разных положениях последовательности (вспомогательная таблица S5). Чтобы понять потенциальное функциональное значение ацетилирования мМДГ, мы исследовали характеристики ферментов в обоих направлениях обратимой ферментативной реакции.

Наш анализ кинетических свойств растительного mMDh2 в направлении восстановления OAA показал, что ацетилирование лизина K172 в P. patens и K169 (соответствует K172 в P. patens ) и K170 в A. thaliana имеют видозависимые противоположные эффекты на активность фермента. Ацетилирование по K172 из P. Patens mMDh2 позволяет ферменту превращать OAA в пируват с удвоенной каталитической скоростью по сравнению с немодифицированным белком.Напротив, включение ацетильной группы в K169 или K170 в мМДh2 A. thaliana приводит к появлению менее эффективных ферментов; ацетилирование K169 снижает сродство к OAA в 2 раза без изменения каталитической скорости, тогда как ацетилирование K170 снижает каталитическую активность чуть более чем на треть скорости по сравнению с немодифицированным белком. Недавний анализ белкового состава отдельной средней митохондрии растения из культивируемых гетеротрофных клеток A. thaliana показал, что mMDh2 очень распространены, около 13.190 копий на митохондрию (Fuchs et al. , 2020). Добавление in vitro изменений активности , измеренных здесь, к этой модели, немодифицированный mMDh2 будет иметь способность превращать 7,2 млн молекул OAA в секунду в одной митохондрии, в то время как ацетилирование на K170 снизит эту способность преобразования до 2,7 млн ​​молекул. в секунду.

Мы обнаружили, что число оборотов немодифицированного mMDh2 A. thaliana в два раза выше, чем у немодифицированного mMDh2 P. patens (рис.4B), предполагая, что ферменты различаются по своим основным свойствам по отношению к субстратам у разных видов. Эти различия, вероятно, проявляются как адаптации к метаболической среде у видов и, вероятно, являются результатом адаптивных конфигураций в активном центре и / или более дистальных областях белков. Интересно, что противоположные эффекты ацетилирования остатков лизина в обоих ферментах изменяют число оборотов ацетилированных белков до значений, аналогичных тем, которые обнаружены в немодифицированном ферменте другого проанализированного вида: число оборотов P.Patens мМДh2, ацетилированный в K172, имеет такое же значение, что и немодифицированного мМДх2 A. thaliana , тогда как A. thaliana мМДh2, ацетилированный в K170, имеет такое же число оборачиваемости, что и у P. . Эти наблюдения предполагают, что изменения числа оборотов, вызванные ацетилированием растительного mMDh2, происходят между минимальными и максимальными значениями, которые устанавливаются структурой и каталитическим механизмом растительного фермента. Хотя точный молекулярный механизм изменений числа оборотов еще предстоит определить, интересно отметить, что аминокислота 173 в P.patens мМДh2 (соответствует K170 в A. thaliana мМДч2) представляет собой аргинин, который имеет свойства, аналогичные свойствам перманентного неацетилированного лизина (Kamieniarz and Schneider, 2009). Принимая во внимание, что присутствие ацетил-лизина в положении 170 A. thaliana мМДh2 снижает число оборачиваемости фермента, присутствие аргинина в мМДh2 P. patens в том же положении предполагает, что P. patens mMDh2 адаптирован, чтобы избежать дальнейшего снижения его ферментативной активности, по крайней мере, за счет ацетилирования.Эта интерпретация соответствует более низкому значению k _cat , которое мы измерили для немодифицированного mMDh2 P. patens по сравнению с таковым для фермента A. thaliana дикого типа (рис. 4B).

Анализ влияния ацетилирования K172 в P.atens, и K169 и K170 в A. thaliana, на кинетические свойства мМДГ2 в направлении окисления малата показал существенное различие между обоими видами растений.Хотя кинетические свойства P. patens и A. thaliana мМДh2, ацетилированных по соответствующим остаткам лизина (K172 в P. patens и K169 в A. thaliana ) не были изменены, ацетилирование A. thaliana мМДh2 при K170 снижает ферментативную каталитическую эффективность до 67,5% немодифицированного фермента из-за сильного снижения сродства к малату (рис. 4B).

Остатки лизина, соответствующие K169 и K170 из A.thaliana mMDh2, которые влияют на ферментативную активность A. thaliana и P. Patens mMDh2 в зависимости от ацетилирования, консервативны в растениях и, как было обнаружено, ацетилированы у нескольких видов. Ни в одном случае не было обнаружено, что остатки ацетилированы одновременно. Тот факт, что K169 и K170 были независимо ацетилированы в разных органах (листьях и зародышах) риса, может указывать на необходимость тонкой настройки активности фермента, чтобы справиться с конкретными метаболическими потребностями органов.

Наш анализ смоделированных белковых структур показывает, что критические остатки лизина не находятся вблизи каталитического сайта или на границах раздела димера или тетрамера. Хотя точный молекулярный механизм того, как ацетилирование влияет на каталитические свойства фермента, еще предстоит выяснить, похоже, что ацетилирование вызывает конформационные изменения, которые затрагивают структуру белка.

Ацетилирование консервативного лизина на карбоксильном конце

Последовательности 120 ацетилированных белков A. thaliana , идентифицированных König et al. (2014a) были получены от Tair (https://www.arabidopsis.org/tools/bulk/sequences/index.jsp), а последовательности ацетилированных и классифицированных белков P. patens были получены из Peatmoss (https: //торф.online.uni-marburg.de/ppatens_db/pp_search_input.php) (Fernandez-Pozo et al. , 2020). Аминокислотные последовательности обоих видов были объединены и кластеризованы с использованием программы множественного выравнивания MAFFT Version 7 с настройками по умолчанию (Katoh et al. , 2002, Katoh et al. , 2019). P. patens и A. thaliana последовательности белков ортологичных групп были снова выровнены с Muscle (Edgar, 2004) с использованием программного обеспечения Mega 7 (Kumar et al. , 2016).Всего было идентифицировано 22 кластера из белков P. patens и A. thaliana с гомологами, имеющими сходство последовательностей более 40%. В каждый кластер было включено разное количество паралоговых белков каждого вида. Сравнивали сайты ацетилирования и положения аминокислот белков каждой ортологической группы. Были перечислены сайты ацетилирования и извлечены позиции из исходного выравнивания (таблица 1, вспомогательная таблица S4, вспомогательные данные S1).

Филогенетический анализ, сравнение закономерностей сохранения последовательности и ацетилирования лизина мМДГ различных видов растений

Опубликованные наборы данных по ацетилому были проверены на присутствие митохондриальной малатдегидрогеназы.Всего в анализ были включены 17 наборов данных для 10 различных цветковых растений (вспомогательная таблица S5). Для семи видов цветковых растений обнаружено ацетилирование лизином белков мМДГ. Растительные ткани или органы, в которых были обнаружены эти мМДГ, ацетилированные лизином, приведены в вспомогательной таблице S5. Предполагаемые ортологи мМДГ этих видов были идентифицированы с помощью поиска с помощью инструмента Basic Local Alignment Tool (BLAST) с использованием последовательности белка A. thaliana mMDh2 в качестве запроса к базе данных неизбыточных белков (BLASTP) и к базе данных транслированных нуклеотидов (TBLASTN) (Altschul et al., 1990) из разных источников. Данные о последовательности выбранных видов покрытосеменных C. sinensis , V. vinifera , O. sativa, B. distachyon, F. ananass и зеленых водорослей C. reinhardii были депонированы в NCBI (www.ncbi. nlm.nih.gov) и данные о последовательностях P. patens и M. polymorpha депонированы в Phytozome v12.0 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html). Последовательности предполагаемых ортологов mMDH Azolla и Salvinia доступны в Fernbase (www.fernbase.org). Для P. sativum в качестве источника последовательностей использовалась база данных URGI (Kreplak et al. , 2019). Последовательности Anthoceros были извлечены из недавно опубликованного генома штамма A. agrestis , Bonn v1 v1.1 (Li et al. , 2020). Для каждого вида были загружены 2-10 лучших совпадений, которые были согласованы в проводнике выравнивания MEGA с помощью инструмента MUSCLE (Tamura et al. , 2015, Kumar et al. , 2016) с последующей ручной корректировкой.

Выравнивание аминокислотных последовательностей использовали для расчета филогении присоединения соседей с 1000 бутстрепов (модель Пуассона, гамма-распределение, частичная делеция с отсечением 90%), включая пероксисомальный (AT2G22780), пластидный (AT3G47520) и митохондриальный A. thaliana белки мМДГ. С сокращенным набором данных (подтверждающие данные S2), включающим все белки MDH идентифицированного митохондриального кластера, глиоксисомальные / пероксисомальные и пластидные MDH P. patens и A. thaliana и MDH E.coli и mMDh3 человека, мы построили филограмму максимального правдоподобия с использованием программного обеспечения IQ-tree версии 1.6.12 (Trifinopoulos et al. , 2016). Мы применили модель LG + G4 для эволюции последовательности как наиболее подходящую модель, определенную ModelFinder (Kalyaanamoorthy et al. , 2017). Мы определили достоверность каждого узла из 1000 повторений начальной загрузки с помощью приближения сверхбыстрой начальной загрузки «UFBoot» (Hoang et al. , 2018). Параллельно мы рассчитали филогенез соединения соседей с теми же настройками, что описаны выше (подтверждающий рис.S1). Последовательности белков мМДГ, идентифицированных как ацетилированные, были выровнены, и консервация была отображена с использованием программного обеспечения GeneDoc (https://genedoc.software.informer.com/2.7/).

Клонирование

кДНК, кодирующая зрелый белок mMDh2 (без сигнального пептида) из A. thaliana (Hüdig et al. , 2015) была введена в pCDF PylT- 1 (SmR; промотор T7 ; терминатор T7 ) (Neumann et al., 2009 г.). Этот вектор обеспечивает экспрессию белков, слитых с N-концевой меткой His, для очистки с помощью аффинной хроматографии Ni-NTA. Кассету mMDH получали с помощью ПЦР с использованием праймеров mmdh2_GibFw и mmdh2_GibRv и клонировали сборкой Гибсона. Последовательность полученной плазмиды проверяли секвенированием. Вектор pCDFmdh2 использовали в качестве матрицы для сайт-направленного мутагенеза с помощью ПЦР для замены специфических лизиновых кодонов на янтарный кодон с использованием праймеров, перечисленных в вспомогательной таблице S6.Были созданы следующие конструкции: pCDFmdh2amb170, pCDFmdh2amb325, pCDFmdh2amb329, pCDFmdh2amb334. Включение желаемых нуклеотидных изменений подтверждали секвенированием (Macrogen).

Клонирование

Кодирующая последовательность mMDh2 (без сигнального пептида) P. patens Gransden (ген Pp1s201_6V6.1) (Lang et al. , 2018) была амплифицирован с праймерами MfeI_PpMDh2_f и KpnI_PpMDh2_r (вспомогательная таблица S6).Версия mMDh2 с янтарным кодоном для позиции 172 аминокислоты была создана с помощью ПЦР с перекрывающимся удлинением с внутренними праймерами (PpMDh2_KStop_f и PpMDh2_KStop_r, вспомогательная таблица S6). Фрагменты вводили в вектор pCDF PylT-1 (SmR; промотор T7 ; терминатор T7 ) между сайтами рестрикции MfeI и KpnI (SmR; промотор T7 ; терминатор T7 ) (Neumann et al. , 2009) для создания mMDh2, меченного по N-концу His.Включение желаемых нуклеотидных изменений подтверждали секвенированием (Macrogen).

Экспрессия и очистка ацетилированных мМДГ

Все конструкции экспрессии pCDF PylT, несущие версии mMDh2 с янтарным кодоном вместо кодона для ацетилируемого лизина, и конструкции, несущие соответствующий мМДГ2 дикого типа, были трансформированы в E. coli Розетта2 (DE3). Плазмида pBK-AcKRS3, несущая ацетил-лизил-тРНК синтетазу (AcKRS) (Neumann et al., 2008), котрансформировали плазмидами pCDF PylT. Для продуцирования гетерологичного белка трансформированные клетки выращивали в 400 мл среды LB в присутствии соответствующего антибиотика в каждом случае при 37 ° C и 16 г до OD600 0,4-0,6. В среду роста добавляли 10 мМ N-ацетил-лизин и 20 мМ никотинамид за 30 мин до индукции. Чтобы вызвать экспрессию гетерологичного белка, к культуре добавляли 1 мМ IPTG и клетки инкубировали в течение 20 ч при 30 ° C и 16 г .Клеточную культуру собирали при 6000 г в течение 15 минут, и гранулы хранили при -20 ° C до использования.

Для экстракции белка осадки размораживали на льду, ресуспендировали в 20 мМ трис-HCl (pH 8,0), содержащем 500 мМ NaCl, 5 мМ имидазол, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и кончик шпателя лизоцима, обрабатывали ультразвуком и центрифугировали при 14000 g в течение 20 минут при 4 ° C. Супернатант использовали для очистки белка с помощью гравитационной хроматографии с иммобилизованными ионами металлов на агарозе никель-нитрилотриуксусной кислоты (Ni-NTA Agarose, ThermoFisher).Колонку предварительно уравновешивали 20 мМ трис-HCl буфером, содержащим 500 мМ NaCl и 5 мМ имидазол. После загрузки супернатанта колонки промывали в четыре этапа 500 мМ NaCl в 20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), содержащем возрастающие концентрации имидазола (5, 40 и 60 мМ). Элюцию белка проводили в четыре этапа: 500 мкл 20 мМ трис-HCl, 500 мМ NaCl и 200 мМ имидазола. Наконец, колонки Vivaspin® 10K (Satorius, Германия) использовали для концентрации белка и замены буфера (HEPES 50 мМ, pH 7.4). Выделенные рекомбинантные белки анализировали с помощью SDS-PAGE и LC-MS / MS (см. Выше) для проверки целостности и чистоты. Концентрацию белка определяли с помощью анализа Amido black (Dieckmann-Schuppert and Schnittler, 1997).

Кинетическая характеристика ацетилированного mMDh2

Анализы активности MDH проводили в системе Synergy HT Biotek Plate Reader при 25 ° C. Восстановление OAA определяли после окисления NADH при 340 нм (ε = 6,2 см ^-1 мМ ^-1 ).Среда для анализа содержала 50 мМ Hepes-KOH pH 7,5, 10 мМ MgCl ₂ , 5 мМ NADH и различные концентрации OAA в диапазоне от 0,01 до 4 мМ. Окисление малата определяли после восстановления НАД при 340 нм в аналитической среде, содержащей 50 мМ Hepes-KOH pH 7,5, 10 мМ MgCl _2, 4 мМ НАД и переменную концентрацию малата в диапазоне от 0,01 до 10 мМ.

Реакции запускали добавлением субстрата. Кинетические константы были рассчитаны как минимум с тремя различными партиями ферментов, каждая по крайней мере в трех повторностях, и скорректированы по уравнению Михаэлиса-Ментен с помощью нелинейной регрессии с помощью Prism 6 (GraphPad Software).

Гель-электрофорез

SDS-PAGE выполняли с использованием 14% (мас. / Об.) Полиакриламидных гелей в соответствии с (Laemmli, 1970) и маркеров молекулярной массы Spectra Multicolor Broad Range Protein Ladder от ThermoFisher Scientific. Белки визуализировали окрашиванием кумасси бриллиантовым синим. Очищенные ферменты анализировали на неденатурирующем 7% (мас. / Об.) Полиакриламидном геле с использованием маркеров β-амлиазы (200 кДа), алкогольдегидрогеназы (150 кДа) и бычьего сывороточного альбумина (66 кДа) от Sigma Aldrich.Анализы активности мМДГ в геле проводили путем инкубации гелей в темноте при комнатной температуре в реакционном буфере, содержащем 50 мМ K ₂ PO ₄ (pH 7,4), 5 мМ малат, 0,2 мМ НАД, 0,05% (масс. / v) NBT и 10 мкМ PMS, как описано у Hüdig et al. (2015).

Статистический анализ

Статистический анализ кинетических данных был проведен на данных по меньшей мере трех биологических повторностей, каждый измерен по крайней мере в трех повторностях. Для проверки статистических различий значения P определяли с использованием непарного t-критерия.Статистический анализ распределения ацетилирования в органеллярных белках и неорганических белках проводили с помощью теста хи-квадрат с использованием пакета Excel, XLSTAT (Addinsoft).

Гомологическое моделирование трехмерных структур mMDH

Трехмерные модели структур MDH E. coli (код PDB 1EMD) и H. sapiens MDh3 (код PDB 2DFD) были получены из банка данных белков RSCB. (https://www.rcsb.org/). Обе модели A. thaliana и P. Patens mMDh2 были получены с использованием сервера прогнозирования структуры белка phyre2 (http: // www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) с соответствующей аминокислотной последовательностью в качестве входных данных. Молекулы лиганда NAD ⁺ и цитрат были подобраны вручную путем сопоставления структуры MDh3 H. sapiens (код pdb 2DFD) с смоделированными структурами A. thaliana и P. patens mMDh2. Изображения моделей были подготовлены с использованием PyMOL v.2.4.0 от Schrödinger (https://pymol.org/).

ПРАЙМ PubMed | [Исследования биодоступности двух препаратов спиронолактона (авторский перевод)]

Цитирование

Vergin, H, et al.«[Исследования биодоступности двух препаратов спиронолактона (авторский перевод)]». Arzneimittel-Forschung, vol. 31, нет. 9, 1981, стр. 1498-503.

Vergin H, Nuss U, Schwarzländer F, et al. [Исследование биодоступности двух препаратов спиронолактона (авторский перевод)]. Arzneimittelforschung . 1981; 31 (9): 1498-503.

Vergin, H., Nuss, U., Schwarzländer, F., Strobel, K., Weigand, W., & Hitzenberger, G. (1981). [Исследование биодоступности двух препаратов спиронолактона (авторский перевод)]. Arzneimittel-Forschung , 31 (9), 1498-503.

Vergin H, et al. [Исследования биодоступности двух препаратов спиронолактона (авторский перевод)]. Arzneimittelforschung. 1981; 31 (9): 1498-503. PubMed PMID: 7197963.

TY — JOUR Т1 — [Исследования биодоступности двух препаратов спиронолактона (авторский перевод)]. AU — Vergin, H, AU — Нусс, У, AU — Schwarzländer, F, АС — Штробель, К, AU — Вейганд, Вт, AU — Hitzenberger, G, PY — 1981/1/1 / pubmed PY — 1981/1/1 / medline PY — 1981/1/1 / entrez SP — 1498 EP — 503 JF — Arzneimittel-Forschung JO — Arzneimittelforschung ВЛ — 31 ИС — 9 N2 — В предварительном открытом исследовании биоэквивалентности ориентирующего характера (n = 4) однократная доза спиронолактона 100 мг (исследование I) привела к максимальным уровням канренона в плазме (определенным с помощью ВЭЖХ) 126.5 +/- 28,4 нг / мл (стандартный состав 1) и 130 +/- 13,1 нг / мл (тестируемый состав 2). Соответствующие значения суммы флуорогенных метаболитов составили 418,9 +/- 43,5 нг (экв.) / Мл состава 1 и 469,9 +/- 80,3 нг (экв.) / Мл состава 2. Сравнение AUC для общих флуорогенных метаболитов и канренона не показали заметных различий. Во 2-м перекрестном исследовании биоэквивалентности с многократным дозированием для канренона были получены средние минимальные стационарные уровни 102,5 +/- 14 нг / мл (состав 1) и 98,1 +/- 14,1 нг / мл (состав 2), и 389 +/- 35.8 нг (экв.) / Мл (состав 1) и 391,4 +/- 18,9 нг (экв.) / Мл (состав 2) для общей флуоресценции. AUC для элиминации после стабилизации состояния, начиная с последней дозы спиронолактона на 10-й день, были сопоставимы. По расчетам, они составили 13226 +/- 828 нг (экв.) / Мл. ч (состав 1) и 13858 +/- 651 нг (экв.) / мл. ч (состав 2) для общей флуоресценции и 3222 +/- 217 нг / мл (состав 1) и 3167 +/- 195 нг / мл (состав 2) для канренона. Оба препарата спиронолактона можно рассматривать как биоэквивалентные.Период полувыведения (t 1/2) после однократного приема 100 мг спиронолактона составляет (Исследование I) 16,4-19,1 ч для канренона и 13,6-14,0 ч для суммы активных (т. Е. Антагонистических по отношению к альдостерону). метаболиты. Определенные терапевтические условия (например, многократный прием 100 мг спиронолактона с tau = 12 ч, исследование II) могут привести к незначительному увеличению значений t 1/2 как для канренона (18,6-21,4 (ч)), так и для общих флюорогенных метаболитов (15,8- 16,9 (ч)). Стабильный уровень для обоих составов достигается к третьему дню лечения.SN — 0004-4172 UR — https://www.unboundmedicine.com/medline/citation/7197963/[bioavailability_studies_of_two_spironolactone_preparations__author’s_transl_estive_ БД — ПРЕМЬЕР DP — Unbound Medicine ER —

солнечный парус — Параболическая дуга

Программа NASA Innovative Advanced Concepts (NIAC)
Награда за этап II: до 500000 долларов на 2 года

Дифракционные световые паруса
Grover Swartz72 Institute of Technology

Солнечные паруса приводятся в движение свободным и сильным импульсом, который дает солнечный свет.Движение и навигация достигаются путем направления отраженного или проходящего света от естественного направления солнечного света. Величина и направление этой силы радиационного давления зависят от таких факторов, как угол отклонения света, угол наклона паруса по отношению к Солнцу и расстояние от Солнца. Площади под парусом площадью сотни квадратных метров были предусмотрены на протяжении почти 100 лет для широкого круга космических миссий, которые не подходят для химических ракет.

(подробнее…)

Хантингтон-Бич, Калифорния, пятница, 25 мая 2018 г. (Rocket Lab PR) — Американский поставщик орбитальных запусков Rocket Lab сегодня подтвердил новое окно запуска предстоящей миссии «Пришло время для бизнеса». 14-дневное окно запуска будет открыто с 23 июня по 6 июля (NZST), с возможностью запуска с 12:30 до 16:30 NZST ежедневно (00:30 — 04:30 UTC).

(подробнее…)

ПАСАДЕНА, Калифорния, 30 мая 2015 г. (Планетарное общество, PR) — После успешного запуска на орбиту на борту ракеты Атлас V Объединенного стартового альянса с мыса Канаверал, Планетарное общество Космический корабль LightSail ™ замолчал после двух дней общения. Испытательная миссия космического корабля на солнечной энергии, предшествующая миссии 2016 года, теперь возобновила контакт после того, как предполагаемый сбой программного обеспечения повлиял на связь. Команда LightSail скоро определит, когда следует попытаться развернуть солнечные паруса Mylar® космического корабля.

Билл Най (The Science Guy), генеральный директор The Planetary Society, сделал следующее заявление:

«Наш LightSail позвонил домой! Оно живое! Наш космический корабль LightSail перезагрузился, как и предсказывали наши инженеры. Все в восторге. Мы были готовы еще к трем неделям беспокойства. Тем временем команда написала программный патч, готовый к загрузке. После того, как мы будем уверены в пакетах данных о нашей орбите, мы примем решение о загрузке патча и развертывании наших парусов — и мы примем эти решения очень скоро.Здесь, на Земле, для нас это были американские горки, пока наш способный маленький космический корабль находился на орбите и занимался своими делами. В ближайшие два дня у нас будет больше новостей, и теперь я надеюсь, что они будут очень хорошими ».

За подробным описанием испытаний LightSail и миссий 2016 года следите за встроенным репортером Джейсоном Дэвисом на сайте planetary.org/blogs/jason-davis.

На этой неделе в The Space Review ….

Критика Гриффином нового направления НАСА
Майк Гриффин почти четыре года отвечал за НАСА, создавая исследовательскую архитектуру, которую администрация теперь хочет демонтировать в пользу нового подхода к исследованию космоса человеком .Джефф Фуст сообщает о том, что Гриффин сказал об этом новом направлении и о том, что такое «настоящая» космическая программа, в своем выступлении на прошлой неделе.

Веха для солнечного парусного спорта
В июне японский космический корабль IKAROS стал первым, кто успешно вывел на орбиту солнечный парус, долгожданное достижение для небольшого сообщества экспорта солнечного парусного спорта. Киран Кэрролл делает обзор этого достижения и текущего состояния солнечного парусного спорта, обсуждавшегося на недавней конференции.

Общественный интерес к космосу, по номерам
Достаточно сложно измерить популярность спорта; можно ли сделать то же самое с пространством? Дрю Хэгквист исследует некоторые показатели, с помощью которых можно попытаться количественно оценить общественную поддержку космических полетов.

Обзор: Большие вопросы: Вселенная
Астрономия является предметом некоторых из самых больших и фундаментальных вопросов о нашем существовании. Джефф Фауст рассматривает книгу, в которой исследуются некоторые из этих важных вопросов, включая как те, которые были решены, так и те, на которые еще нет ответа.

Исследователи из Финского метеорологического института добились значительного прогресса в разработке потенциально революционного электрического паруса на солнечном ветру, сообщает Next Big Future. Парус состоит из длинных металлических тросов и электронной пушки на солнечной энергии, которая поддерживает положительный заряд тросов. Солнечный ветер оказывает постоянное давление на космический корабль и тросы.

«Электрический парус — чрезвычайно многообещающая новая двигательная техника, которая почти готова к испытаниям.Если электронное нагревание окажется успешным, производительность может быть увеличена еще больше. Стоимость миссий по солнечной системе снизится, и появятся новые возможности и характеристики ».

Профессор РИТ разработает дифракционные солнечные паруса | Tech Pulse | Июл 2019

В течение следующих двух лет профессор Рочестерского технологического института (RIT) Гровер Шварцлендер изучит возможность использования дифракционных солнечных парусов для запуска космических кораблей.Он получил награду Phase II в рамках программы NASA Innovative Advanced Concepts (NIAC) за поддержку своих исследований.

«Мы вступаем в новую эру космических путешествий, в которых используется давление солнечной радиации на большие и тонкие мембраны парусов», — сказал Шварцлендер. «По сравнению с отражающим парусом, мы думаем, что дифракционный парус может быть более эффективным и лучше выдерживать воздействие солнечного тепла.Эти паруса прозрачны, поэтому они не будут поглощать много тепла от солнца, и у нас не будет проблем с отводом тепла, как у вас с металлической поверхностью ».

Swartzlander провел девятимесячное исследование NIAC фазы I в 2018 году, кульминацией которого стало собрание инкубатора в Вашингтоне, округ Колумбия, с целью создания дорожной карты для продвижения метаматериальных парусов на кубесатах. В конечном итоге Шварцлендер хочет использовать дифракционные паруса, чтобы установить созвездие спутников на разных орбитах вокруг Солнца, чтобы обеспечить его обзор на 360 °.Он надеется увидеть миссию в течение следующих пяти лет, которая продемонстрирует, как дифракционные солнечные паруса будут работать в космосе.